猪唾液酸粘附素抗原表位蛋白在大肠杆菌体内的表达及其多克隆抗体的制备
猪呼吸与繁殖综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRS virus,PRRSV)感染引起的,以母猪流产、死胎等生殖障碍和仔猪呼吸疾病等为特征的急性传染病,每年都给全球养殖业带来巨大的损失。PRRSV分子有多个结构蛋白,与病毒的粘附、感染等过程均有紧密关联。目前RPPSV的确切致病机制尚无定论。已有研究显示,PRRSV的主要感染通道是攻击巨噬细胞,特别是肺泡巨噬细胞。通常PRRSV先与细胞膜上受体结合再经过内吞作用侵染到细胞内部。现已知巨噬细胞上主要有三种受体参与PRRSV的粘附、内吞、脱衣壳等过程,分别是硫酸乙酰肝素(heparan sulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,sn)和CD163。其中Sn是介导PRRSV内吞的主要受体,将Sn基因转染至PRRSV的非受纳细胞系后即可导致病毒感染。因此研究Sn的结构和功能对深入了解RPPSV的致病机理有重要意义。Sn是位于巨噬细胞膜上的跨膜蛋白,大部分结构域的功能仍有待研究。制备相关抗原决定簇或结构域的抗体对研究Sn在介导病毒感染和受体间的相互作用是十分必要的。
本实验通过DNAstar软件分析了Sn基因编码序列抗原性指数,从N端胞外区选取了由114个氨基酸残基组成的多肽片段(Sn114)作为预期抗原,并根据大肠杆菌偏爱的密码子优化了编码基因。将Sn114基因连接到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点上,构建成上游融合硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx),下游融合6×His-tag的融合表达载体pET-32a-Sn114。将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达重组Sn114融合蛋白,再使用Ni-NTA Agarose纯化表达产物。将纯化的Sn114蛋白免疫家兔后收获血清抗体,ELISA法测定抗体效价,并通过Western-blot和巨噬细胞结合试验检测抗体对完整Sn蛋白和巨噬细胞的识别、结合能力。SDS-PAGE和Western-blot结果表明,重组Sn114融合蛋白确实得到了高效表达和理想的纯化效果。免疫34 d后血清抗体的滴度达到了1:10240。抗体的特异性检测结果表明,抗体能识别完整的Sn蛋白,并能与巨噬细胞特异性结合。综上所述,Sn抗原表位蛋白Sn114得到了表达,本实验制备的Sn多克隆抗体具有良好的生物活性和特异性,这为以后研究Sn在病毒感染中的作用机制提供了必要条件。
猪呼吸与繁殖综合征;唾液酸粘附素;抗原表位蛋白;大肠杆菌;多克隆抗体
河北农业大学
硕士
基础兽医学
仲飞
2012
中文
S858.28;S852.612
49
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）