小鼠Myostatin基因表达载体的构建及体外表达鉴定
目的：
随着现代生活习惯的改变和生活质量的提高，很多人开始胖起来，肥胖症已渐渐成为危害全球人类健康的重要疾病，与2型糖尿病、高血压、心脑血管疾病、脂代谢异常、胰岛素抵抗、非酒精性肝病、哮喘以及关节炎等等多种疾病的发生发展密切相关。脂肪细胞中脂质的过度积聚是肥胖症形成其中的中心环节，多种因素参与过程其中，但是发病机制还不完全清楚，因此关于此方面的研究，对肥胖症的防治有重要意义并逐渐成为热门的课题。1997年美国基因学家发现肌肉生长抑素(Myostatin)及其基因(MSTN)，对肌肉生长具有抑制作用，目前研究者普遍认为肌肉是全身最大的耗能组织之一，肌肉生长抑素的缺乏可导致肌肉异常增生，同时可能出现肌肉耗能增加，从而调控能量的分配，对认识肥胖的发病机制可能有重大的意义。本研究拟用质粒构建技术及基因表达技术，构建该基因的表达载体，期待用于观察MSTN基因过表达对肥胖小鼠体重、内脏脂肪含量、糖脂代谢等的影响，进而进一步通过该工具观察探讨MSTN与肥胖症的关系。
方法：
1、小鼠MSTN蛋白表达质粒pcDNA3.1(+)-mMSTN的构建：
1.1、mMSTNcDNA插入片段的扩增：从ICR小鼠肌肉组织中提取总RNA，经RT-PCR，获得大量拷贝的MSTNcDNA，然后插入pEASY-T1克隆载体中，经BamHⅠ、ApaⅠ双酶切后，获得带有酶切位点的小鼠MSTN表达序列片段。
1.2、载体片段的获得：以pcDNA3.1(+)质粒转化TOP10感受态细菌，得到该质粒的大量拷贝后，大量提取，经BamHⅠ、ApaⅠ双酶切后，进行琼脂糖电泳回收，获得用于构建mMSTN表达质粒的载体片段。
1.3、应用T4DNA连接酶，将带有酶切位点的mMSTN扩增片段，与pcDNA3.1(+)质粒酶切以后的载体片段进行连接，构建成pcDNA3.1(+)-mMSTN质粒。
2、pcDNA3.1(-)-mZAG表达质粒的体外鉴定：应用阳离子脂质体转染方法将pcDNA3.1(+)-mMSTN质粒瞬时转染到小鼠3T3-L1前脂肪细胞中,48h后收集细胞提起RNA，逆转录合成cDNA后，用real-timePCR方法观察细胞中MSTN的表达情况。
结果：
1．成功克隆小鼠MSTNcDNA全序列，并将其与pcDNA3.1(+)载体片段连接，构建成pcDNA3.1(+)-mMSTN表达质粒。
2．在体外培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞系中，证实MSTN表达质粒pcDNA3.1(+)-mMSTN可以在脂肪细胞中良好表达。
结论：
成功构建了pcDNA3.1(+)-mMSTN表达质粒，在体外能良好表达鼠源MSTN蛋白，是研究MSTN作用的一种有效工具。
肌肉生长抑素;质粒构建;3T3-L1前脂肪细胞;脂质体转染;基因表达;肥胖症
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
临床医学
邓洁英
2011
中文
R589.202;R361.3
62
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）