与Ⅰ型单纯疱疹病毒感染相关的细胞内反应抑制蛋白HIRRP的功能研究
病毒和宿主细胞间的相互作用充分体现了自然界生物物种间相互斗争又相互依存的关系。病毒与宿主细胞间的相互作用是复杂而广泛的。在病毒感染细胞的过程中，病毒能与宿主细胞内的多种组分发生作用，进而导致宿主细胞的蛋白表达谱发生改变，而这些差异蛋白正是被感染细胞内产生一系列生物效应的分子基础。单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVI)是一种具有较强传染性的双链DNA病毒，在人群中感染率很高。本研究的前期工作通过2-DE差异蛋白电泳在HSVI感染后的人肝L02细胞中，筛选并鉴定出表达明显升高的差异蛋白分子之一Unnamed protein(UP)。但目前人们对它的认识几乎为“零”，还没有任何关于UP蛋白功能的研究工作被报道。
本课题的研究重点是分析HSVI病毒感染L02细胞后表达升高的差异蛋白UP在HSVI病毒与细胞相互作用过程中的功能意义。课题以病毒学、细胞生物学、分子生物学和免疫学等实验为基础，结合报告基因、酵母双杂交、免疫共沉淀和凝胶电泳迁移率变更实验(EMSA)等研究方法，对UP的功能特性和与其相互作用的细胞内蛋白进行了初步研究。首先，通过Northern Blot杂交、Real-time PCR和Western Blot杂交实验，分析并证实了UP蛋白的表达与HSVI的感染具有密切联系。其次，通过UP-GFP融合蛋白在细胞内的荧光定位实验，发现正常状态下UP蛋白定位于细胞胞浆，而HSVI感染后，部分UP蛋白能实现从胞浆向胞核的转移，且该现象在不同类型的细胞中并无差异；再次，通过空斑形成单位实验(PFU)发现上调UP蛋白的表达能抑制HSVI病毒的活性，而UP蛋白的低表达则能逆转UP对HSVI病毒的抑制作用；另外，CAT报告基因实验证明，UP蛋白对HSVI立早、早期和晚期某些典型基因的转录调控活性具有抑制作用，且发挥该抑制作用的功能结构域主要位于UP蛋白N末端大约1-80位氨基酸的区域；并且，应用酵母双杂交实验，筛选到与UP蛋白在细胞内相互作用的下游分子之一：激活转录因子5(activating transcription factor 5，ATF5)；更进一步通过免疫共沉淀实验证实UP与ATF5两者在真核细胞中存在蛋白一蛋白间的相互作用；接下来，应用EMSA实验发现UP蛋白与ATF5经典的DNA结合位点CRE-DNA序列无直接结合效应，提示UP可能是作为一个转录辅抑制因子通过与ATF5产生相互作用，进而影响ATF5对下游靶基因的转录调控功能，结果表现为：UP蛋白对HSVI病毒活性的抑制及产生一系列特定的生物学效应。
通过对UP蛋白功能的初步研究，综合分析以上实验结果，我们初步推测：作为HSVI感染后细胞内出现的应激分子，UP蛋白有可能通过细胞辅抑制因子复合物的形式调控了某些特殊基因的转录，以使感染细胞对病毒的刺激产生适宜性应答。由此我们也尝试将Unnamed Protein更名为HSVI感染反应抑制蛋白(HSVI Infection Response Repress Protein，HIRRP)，简称HIRRP。以上研究结果在一定程度上提示了一种病毒与细胞辅抑制因子复合物相互作用的新方式，这可能对增强病毒与宿主细胞间相互作用的模式提供新的理解，为病毒感染、复制和致病的分子机理提供新的参考，还可能为病毒的预防和治疗提供新的思路和线索。
单纯疱疹病毒Ⅰ型;差异蛋白;反应抑制蛋白;激活转录因子5;转录抑制
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
免疫学
李琦涵
2010
中文
R752.102;R361.3
114
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）