原发性醛固酮增多症KCNJ5基因突变及蛋白表达的研究
第一部分，原发性醛固酮增多症KCNJ5基因突变的研究
目的：
原发性醛固酮增多症（原醛症）是一组以醛固酮分泌增多，肾素-血管紧张素系统受抑制但不受钠负荷调节为特点的疾病。2011年Lifton等首次报告36.4％的散发性醛固酮分泌瘤患者有KCNJ5基因的体系突变。该研究立刻引起了全球广大内分泌医师的广泛关注，但我国国内目前尚未见相关报道。
本研究采用PCR测序的方法检测KCNJ5基因在原醛症不同分型即醛固酮分泌瘤(APA)、特发性醛固酮增多症(IHA)、家族性醛固酮增多症(FH)及皮质醇分泌瘤(CPA)、嗜铬细胞瘤(PCC)中的突变情况，并分析基因型与临床表现型的关系，初步探讨KCNJ5基因在肾上腺皮质疾病中的作用。
方法：
1、提取APA(n=48)、IHA的肾上腺结节样增生(NH，n=9)、CPA(n=5)、PCC(n=5)患者组织的总DNA及RNA;提取相应的APA(n=12)及IHA肾上腺结节样增生(n=3)患者外周血DNA作为对照；另提取IHA(n=10)、FH(n=4)患者的外周血DNA;
2、DNA经PCR扩增KCNJ5基因后正反向测序，再将相应的RNA逆转录为cDNA后行PCR扩增KCNJ5基因正向测序，检测上述不同组织中KCNJ5基因的序列；
3、分析KCNJ5基因不同突变型与临床表现型之间的关系。
结果：
1、原醛症患者的KCNJ5基因突变
1)54.2%的APA患者（25/48例）的肿瘤组织中存在p．G15IR或p．L168R的杂合突变，而与其相匹配的12例患者外周血的基因测序正常；
2)25例突变中48%(n=12)为p．G151R突变,52%(n=13)为p．L168R突变；p.G151R突变分别为c.451G＞A(n=10)或c.451G＞C(n=2)；而p.L168R均为c.503T＞G；
3)1例APA患者（1/48例）存在缺失突变，即157位的异亮氨酸(Ile)缺失，为p.157delI或c.469-471delATC;
4)1例APA患者（1/48例）存在插入突变，即在148位氨基酸后插入苏氨酸(Thr)，为p.148dupT或c．444-445insAAC;该突变目前国内、外尚未见报道；
5)IHA结节样增生组织中2例(2/9例)为p.G15IR（均为c.451G＞C）杂合突变,3例（3/9例）为p.L168R杂合突变。
2、原醛症中KCNJ5基因突变患者的临床表型
1)KCNJ5基因突变型组与非突变型组APA患者的临床表型区别
KCNJ5突变型组较非突变型组有较低的BMI（P＜0.01）、较长的低血钾病史（P＜0.01=和明显低的血钾水平（P＜0.01）；在平衡了年龄及性别因素后，突变型组患者的卧、立位醛固酮水平及ARR仍高于非突变型组（P＜0.05=、卡托普利试验的醛固酮抑制率明显低于非突变型组（P＜0.05）；尽管服用高剂量螺内酯治疗，突变型组患者仍有较高的血压水平（P＜0.01）。而对血管紧张素II的反应、肿瘤直径、性别、高血压病史等在突变型组和非突变型组患者间无差异；肿瘤切除后两组患者的血钾均恢复正常，但突变型组患者术后的血压水平仍高于非突变型组（P＜0.05）。
2)KCNJ5基因p.G151R或p.L168R突变型组APA患者的临床表型
KCNJ5基因p.G151R或p.L168R突变型组APA患者之间的年龄、BMI、高血压和低血钾病史、血压、醛固酮水平、瘤体直径等均无差异；但p.G151R突变型组患者较非突变型组的BMI较低（P＜0.05）、低钾血症病程较长（P＜0.05=，血钾水平较低（P＜0.01=、血压较高（P＜0.05=、卧立位醛固酮水平及术后的舒张压较高（P＜0.05=；而p．L168R突变型组较非突变型组患者年轻（P＜0.05=、BMI较低（P＜0.05=、低血钾病程更长（P＜0.05=、血钾水平较低（P＜0.01=、血压较高（P＜0.01）、ARR水平较高（P＜0.05）及卡托普利对醛固酮的抑制率较低（P＜0.05）。
3)KCNJ5基因突变型组的IHA肾上腺结节样增生患者的临床表现与非突变型组比较无统计学差异；但IHA结节样增生突变型组患者比APA突变型患者的卡托普利对醛固酮的抑制率高（P＜0.05）。
3、原醛症患者KCNJ5基因的单核苷酸多态性
与SNP数据库资料比较，APA患者KCNJ5基因突变的SNP基因型未显示有统计学差异(P＞0.1)。
结论：
1、我们的结果显示：散发性APA患者的KCNJ5基因的体系突变发生率为56.3%（27/48例），此突变率高于欧洲（34%，129/380例）[1]、澳大利亚(38%，10/27例)、英国（44%，20/46例）[2]而接近日本（65.20%，15/23例）[3]。提示KCNJ5基因突变率有种族差异。
2、散发性IHA结节样增生患者中也存在KCNJ5基因的体系突变，但结节周边组织未显示KCNJ5基因突变。因例数较少，故尚需增加例数来做进一步研究。
3、CPA及PCC患者中未见KCNJ5基因的突变。
4、KCNJ5基因的p.G151R和p.L168R突变，导致APA患者的不同临床表现，提示KCNJ5基因突变在散发性APA患者疾病发生中有重要作用。
5、本研究人群中检测到p.L168R、p．G151R、p.del157I和p.148dupT四种KCNJ5基因突变类型，其中p.148dupT突变型目前未见国内外文献报道。
第二部分，原发性醛固酮增多症中KCNJ5蛋白的表达
目的：
第一部分研究检测了原醛腺瘤中KCNJ5基因的突变情况及与临床表现的关系，本部分进一步从蛋白水平探讨KCNJ5蛋白的表达在肾上腺皮质疾病中的作用，并分析KCNJ5基因突变型组与非突变型组之间在表达水平上的异同。
方法：
1、提取正常肾上腺皮质(n=8)，原醛症(n=43)包括醛固酮分泌瘤(APA，n=38)和结节样增生(NH，n=5)，肾上腺皮质醇分泌瘤(CPA，n=7)，嗜铬细胞瘤(PCC，n=6)组织的总蛋白，并测定蛋白浓度。
2、Westernblot方法检测上述不同组织中KCNJ5蛋白和内参GAPDH蛋白的表达；分析目的条带和内参照条带的灰度比值，对KCNJ5蛋白的表达进行半定量分析。
3、比较KCNJ5基因突变型组与非突变型组组织中KCNJ5蛋白表达的差异，并结合KCNJ5蛋白表达水平与相应患者的临床资料行相关性分析。
结果：
1、KCNJ5蛋白的表达
1)KCNJ5蛋白的表达在正常肾上腺皮质均高于原醛腺瘤、肾上腺皮质结节样增生和肾上腺皮质醇分泌瘤，差异有统计学意义(P＜0.01)；
2)醛固酮分泌瘤中非突变型组均高于突变型组、肾上腺皮质结节样增生组、肾上腺皮质醇分泌瘤和嗜铬细胞瘤(P＜0.05)；
3)醛固酮分泌瘤p.G151R突变型组和p.L168R突变型组之间KCNJ5蛋白表达量无统计学差异(P＞0.05)；
4)嗜铬细胞瘤组织表达KCNJ5蛋白，其表达量和皮质醇分泌瘤之间无差异（P＞0.05）。
2、KCNJ5蛋白表达量与KCNJ5基因突变
KCNJ5蛋白表达量与KCNJ5基因突变与否呈正相关，r=0.516，P=0.005。
3、KCNJ5蛋白表达量与APA患者临床表型间的关系
KCNJ5蛋白表达量与KCNJ5突变的APA患者临床表现型无明显相关；与无KCNJ5突变的APA患者的临床表现型亦无明显相关。
结论：
1、KCNJ5蛋白在原醛症患者组织中表达低于正常肾上腺，其中KCNJ5基因突变者组织中表达更低，提示KCNJ5基因突变与其蛋白表达下降有关。
2、KCNJ5蛋白的表达与APA患者的临床表现型无相关。
3、KCNJ5蛋白在皮质醇分泌瘤及嗜铬细胞瘤中的表达低于正常肾上腺皮质，其意义有待做进一步研究。
原发性醛固酮增多症;KCNJ5基因;肾上腺皮质疾病;基因突变;蛋白表达
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
内科学(内分泌与代谢学)
曾正陪
2012
中文
R586.240.2;R361.3
107
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）