蛋白磷酸酶4在IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗中的作用机制研究
目的：2型糖尿病是糖尿病的主要类型，占糖尿病患者的90％以上。2型糖尿病的病理生理特点是胰岛素分泌不足或利用障碍。慢性炎症不仅是糖尿病伴随的特征之一，也是引发糖尿病的重要因素之一。2型糖尿病患者促炎因子水平大量升高，而其中的IL-6表现出与胰岛素抵抗和2型糖尿病有强烈的相关性。并且IL-6水平的升高与血糖升高、糖耐量降低和胰岛素敏感性降低高度相关。蛋白磷酸酶4(Proteinphosphatase4，PP4)是PP2A家族的重要成员。它参与调节许多重要的细胞进程，并与胰岛素受体底物4(Insulinreceptor4，IRS4)的降解和肝糖代谢有关。本研究旨在通过建立IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗的细胞和动物模型，分析肝细胞或肝脏组织中PP4表达及活性的变化，探讨PP4在IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗中的作用及其机制。
方法：IL-6(10ng/ml)分别处理人肝癌细胞系HepG2和C57BL/6小鼠原代肝细胞18h和15h，建立胰岛素抵抗的肝细胞模型；在C57BL/6小鼠背部皮下埋植IL-6(18pg/kg-day)缓释泵处理6～9天，建立IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗动物模型。用G418筛选获得稳定转染PP4表达质粒HA-PP4和转染PP4活性抑制突变体质粒FLAG-PP4RL的HepG2细胞克隆；应用PP4-siRNA及PP4-shRNA干扰HepG2细胞与原代肝细胞中PP4的表达，获得PP4低表达的HepG2细胞和原代肝细胞；构建PP4-shRNA腺病毒载体，通过尾静脉注射C57BL/6小鼠和db/db小鼠，建立肝脏PP4低表达的动物模型。测定小鼠血糖、血脂和胰岛素水平。用葸酮法检测细胞和肝脏组织中的糖原水平，Real-timePCR测定糖异生相关基因(G6Pase、PEPCK、PGCl-α)的表达，Westernblot分析细胞或肝脏组织胰岛素信号通路中JNK、P-JNK、IRS1、P-IRS1、AKT、P-AKT、GSK、P-GSK和PP4的水平，用免疫沉淀结合丝/苏氨酸磷酸酶活性分析法测定PP4的活性。免疫共沉淀结合Westernblot检测PP4与IRS-1的相互作用。
结果：1．我们首先以2型糖尿病小鼠-db/db小鼠（C57BL/6背景）为胰岛素抵抗模型，检测到血糖、胰岛素和IL-6水平显著升高，而胰岛素敏感指数(IsI)降低。蒽酮法的检测结果显示肝组织糖原含量显著降低，Westernblot结果表明糖原合成和糖异生相关信号通路受损：JNK的磷酸化和IRS-1的307-Ser磷酸化水平增强，而GSK、AKT的磷酸化水平下降，同时伴有IRS-1表达下降及PEPCK表达增加。这些结果表明db/db小鼠的肝脏发生了明显的胰岛素抵抗。我们还观察到db/db小鼠肝组织中PP4的表达和活性均显著增强，提示PP4可能参与了肝脏胰岛素抵抗的发生。在体外试验中，我们采用10ng/mlIL-6分别处理HepG2细胞和C57BL/6小鼠原代肝细胞18h和15h，建立胰岛素抵抗细胞模型。在这两种细胞的胰岛素抵抗模型中，糖原含量显著下降，糖异生相关基因表达增加，细胞的糖原合成信号通路受损。Westernblot和磷酸酶活性分析结果显示PP4的表达和活性均增强。在IL-6诱导的C57BL/6小鼠胰岛素抵抗动物模型中，血清胰岛素水平升高，ISI降低，肝脏组织中糖原含量显著下降，糖异生相关基因(G6Pase.PEPCK、PGCI-α)的mRNA水平升高。肝脏组织的糖原合成信号通路受损。同时肝脏组织PP4的表达和活性增强。细胞和动物实验结果均提示PP4参与了IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗的发生。2．为了进一步探讨PP4在IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗中的作用及机制，我们针对PP4的表达和活性，分别建立了稳定高表达PP4以及PP4活性被抑制的HepG2细胞克隆，应用PP4-siRNA及PP4-shRNA获得PP4低表达的HepG2细胞和原代肝细胞以及肝脏PP4低表达的C57BL/6小鼠。这些细胞和动物的分析结果表明：①PP4高表达的HepG2细胞中糖原含量降低，糖原合成信号通路受损；②PP4表达降低可以增加IL-6诱导的HepG2细胞、原代肝细胞以及C57BL/6小鼠肝脏中的糖原含量，降低IL-6诱导的糖异生相关基因表达；③抑制PP4活性，HepG2细胞的糖原合成增加，糖原合成信号通路得以恢复。此外，免疫共沉淀及免疫荧光的结果显示，PP4与IRS-1共定位，并存在着相互调节作用。这种相互调节可能在IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗中起关键作用。3．为了进一步明确PP4在db/db小鼠胰岛素抵抗发生中的作用，我们通过PP4-shRNA腺病毒载体降低db/db小鼠肝脏组织中PP4的表达。结果发现db/db小鼠血糖水平下降，糖耐量增强，糖异生减少，有效减弱了db/db小鼠的胰岛素抵抗。
结论：1．在肝胰岛素抵抗的细胞和动物模型中，PP4的表达和活性均显著增强；2．PP4是IL．6信号通路的正调控因子，促进IL-6诱导的肝脏胰岛素抵抗的发生：3．PP4通过两种方式参与IL-6诱导的胰岛素抵抗。一方面，通过激活JNK抑制胰岛素信号通路；另一方面，可能通过与IRS-1直接作用而调节IL-6诱导的胰岛素抵抗。4．PP4表达降低可以有效逆转db／db小鼠的胰岛素抵抗状态。
2型糖尿病;白介素-6;蛋白磷酸酶4;胰岛素抵抗;受体底物;作用机制
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生物化学与分子生物学
黎健
2012
中文
R587.102;R361.3
114
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）