人源性生物人工肝的制备及临床前研究
急性肝衰竭(acuteliverfailure，ALF)是病毒性肝炎一种危重的临床综合征，传统支持治疗病死率高达80％。肝移植是有效的ALF治疗措施，但由于肝供体严重缺乏，许多患者在等待供体过程中死亡。生物人工肝支持系统(bioartificialliversupportsystem,BALSS)是未来最有希望在体外提供全面肝功能支持，使患者顺利过渡到肝移植或肝再生的有效治疗方法。BALSS的关键生物材料是肝细胞。虽然新鲜分离的猪肝细胞和人肝细胞瘤细胞都曾经被用作BALSS的细胞材料，但由于存在过敏反应、病毒感染和诱发肿瘤等不安全因素，临床应用受到很大限制。我们应用SV40Tag和端粒酶转染原代人肝细胞建立了永生化人肝细胞系（immortalizedhumanhepatocytes，IHH）。前期研究表明，IHH表现高增殖活性，可在微载体上高密度培养，体内不具有成瘤性。体外分析表明：IHH具有正常肝细胞的主要功能，表达与肝脏代谢、解毒、合成相关的基因和蛋白。将IHH与肝衰竭血清孵育后，可使血清胆红素进行性地降低，尿素进行性升高，表明IHH具有对胆红素和血氨的解毒功能。
目的：
应用微载体大规模培养IHH，构建人源性生物人工肝(human-derivedbioartificialliver，hBAL)，通过对大量ALF血浆灌流解毒的体外实验和对小鼠ALF模型、恒河猴ALF模型治疗的体内实验，评价hBAL治疗ALF的有效性和安全性，为hBAL进入临床Ⅰ期试验提供依据。
方法：
应用微载体搅拌悬浮方法大规模高密度培养IHH。
采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立裸鼠ALF模型，将微载体培养IHH注射于裸鼠腹腔内进行腹膜透析治疗，并设未治疗组和空微载体治疗组，比较各组动物的肝功能损伤指标，肝组织病理和动物生存率。
将微载体培养IHH和树脂颗粒灌装特制容器构建IHH细胞反应器，连接蠕动泵，对400mLALF血浆灌流解毒6h，IHH细胞反应器再生18h后，再次进行6h灌流解毒，解毒．再生循环6次，观察ALF血浆胆红素、尿素浓度变化，评价IHH细胞反应器的体外解毒功能。
用间隔48h两次注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)的方法建立恒河猴ALF模型，IHH细胞反应器连接血液净化装置制备hBAL，采用连续10h每5h更换新的IHH细胞反应器的连续治疗模式及治疗5h，间隔19h，重复3次的间隔治疗模式对两只ALF恒河猴分别进行了hBAL治疗，观察转氨酶、胆红素、血氨、尿素、胆汁酸、血糖、凝血酶原时间、凝血酶原活动度、纤维蛋白原等肝功能损伤指标的变化及ALF恒河猴生存情况和不良反应，评价hBAL对ALF的疗效和安全性。死亡恒河猴肝组织切片HE染色观察肝坏死情况。对IHH进行了染色体分析及SCID鼠成瘤实验以评价其安全性。
结果：
采用微载体技术可大规模培养IHH，培养体积可达500～600mL。
腹腔注射CCl4后24h，所有小鼠的转氨酶升高达正常值10倍以上。未治疗组和空微载体治疗组动物48h内全部死亡，肝组织检查发现肝细胞广泛坏死；而采用IHH-微载体治疗组48h动物生存率为83.3%，持续14d后转为长期存活。存活的动物转氨酶降至正常水平，肝组织检查显示肝细胞坏死显著减少，免疫组织化学染色显示腹腔微载体上肝细胞仍存活，并表达人肝细胞特异蛋白α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT).
IHH细胞反应器对ALF血浆灌流解毒6h后，可使血浆总胆红素下降18%，解毒-再生循环6次后，可使血浆总胆红素下降41%；血浆尿素从解毒-再生循环第4次起升高，到第6次，总升高幅度为22%，而空微载体对照组ALF血浆相应指标无显著变化。
间隔48h两次注射D-GalN可成功制备恒河猴ALF模型，恒河猴血清转氨酶升高44倍，胆红素升高5.4倍，血氨升高2.5倍，凝血酶原时间＞75秒，凝血酶原活动度＜10%，未经治疗的恒河猴反应迟钝，进食饮水减少，呕吐，尿少，最长生存时间不超过63h。
造模后48h开始连续10h的hBAL治疗可使恒河猴血液肝损伤指标改善：转氨酶下降70～80%;胆红素下降约70%;血氨未继续升高，而尿素水平增高；总胆汁酸(totalbileacid，TBA)下降约75%。治疗终止后上述指标反弹，到造模后4天为反弹高峰。凝血功能未改善，恒河猴生存7.6天。肝组织病理学检查显示与未治疗ALF恒河猴比，肝坏死减轻，肝淤血减少。
造模后24h开始间隔hBAL治疗3次，每次均使转氨酶下降约50%，治疗终止后，转氨酶反弹升高，但造模后4天的反弹高峰幅度较低，仅为连续治疗的39%;间隔hBAL治疗抑制了胆红素升高，造模后4天的反弹幅度为连续治疗的12%;间隔hBAL治疗后尿素水平显著升高，约为连续治疗的一倍，同时血氨无显著升高。间隔hBAL治疗还抑制了TBA的升高，改善了凝血功能，造模后7天，凝血功能恢复正常。经3次间隔hBAL治疗后，ALF恒河猴痊愈而长期存活。
hBAL治疗过程中设备运行稳定，各项参数正常。不良反应有低血压和低血钙，对症治疗后缓解。
染色体分析示IHH为二倍体，IHH移植SCID鼠皮下和肝脏内6个月未成瘤。
结论：
应用微载体培养IHH可成功制备可再生性人源性生物人工肝。体外实验中可使400mLALF血浆胆红素降低，血浆尿素增高，具有解毒功能。体内实验中可使ALF小鼠和ALF恒河猴生存期延长，肝损伤指标改善，疗效显著，安全性好。对ALF恒河猴治疗的间隔治疗模式疗效优于连续治疗模式，在肝损伤较轻时及时给予BAL治疗疗效较好。
急性肝衰竭;人源性生物人工肝;永生化人肝细胞系;治疗效果;安全性;动物试验
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
病理学与病理生理学
娄晋宁
2010
中文
R575.305;R318.14
102
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）