胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究
microRNAs(miRNAs)是由21-25个核苷酸组成的非编码RNA，它通过与靶基因的3’-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达。近年来，其与各种疾病的关系，尤其是与肿瘤的关系的研究成为热点。胰腺癌是临床上治疗困难的疾病，对人类的健康威胁极大，大量研究工作集中于胰腺癌的肿瘤编码基因的筛查和功能的鉴定，关于miRNAs与此疾病的关系知之甚少，研究miRNAs在胰腺癌发病机制中的作用具有重要的意义。
本实验以临床上胰腺癌组织标本和国际上公认的ATCC胰腺癌细胞系Panc-l/Mia PaCa-2为实验对象，用miRNAs芯片筛查胰腺癌组织与正常胰腺组织中差异表达的miRNAs。设定阈值1.5倍，SAM软件分析找到32个差异表达的miRNAs，与对照组比较，其中上调的有18个，下调的有14个。Northern Blotting实验验证了部分的芯片结果：挑选了5个miRNAs分子，其中4个与芯片结果完全一致，一个结果有出入。
依据K-RAS改变是胰腺癌中最典型的特征，并且是导致胰腺癌肿瘤恶性行为的一个关键因素，我们检测了胰腺癌细胞系中K-RAS蛋白水平，有文献报道K-RAS基因是let-7的一个靶基因，因此我们又检测了胰腺癌细胞系中let-7 miRNA的水平，发现与K-RAS的蛋白表达水平成负向关系；接着我们用let-7 miRNA直接导入胰腺癌细胞系Panc-l，检测到K-RAS的蛋白水平下降，而K-RAS的mRNA水平无明显变化，说明let-7的降低是胰腺癌中K-RAS蛋白升高的原因之一。
我们又检测了胰腺癌细胞系以及正常胰腺组织中miR-96的表达水平，发现其在正常胰腺组织比胰腺癌细胞系中的表达下降。用质粒为载体在Mia PaCa-2细胞中高表达miR-96，结果发现K—RAS的mRNA水平不变、而蛋白水平下降，肿瘤细胞的恶性生物学行为（增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力）受到了明显的抑制，同时肿瘤细胞凋亡增强；我们又检测了RAS下游通路中的两个重要分子ERK和AKT的表达有显著下降，它们的活化形式phospho-ERK和phospho-AKT也有不同程度的下降。生物信息学分析miR-96的前体序列发现，各物种间存在多个位点核苷酸的多态性，且位于前体的茎环结构区，但是成熟体的序列十分保守（＞99％序列相同），小鼠的miR-96成熟体序列与人的序列完全一致，因此推测miR-96可能是进化过程中保留下来的具有肿瘤抑制功能的重要分子。
综合前面的结果，我们得出在胰腺癌中miRNAs的表达存在差异，过表达miR-96能在细胞水平上抑制肿瘤的恶性生物学行为，let-7和miR-96的表达下降是胰腺癌的肿瘤恶性行为发展的一个因素，是阐明胰腺癌肿瘤分子机制的一个重要补充。
胰腺癌;非编码RNA;靶基因;病变组织;恶性生物学行为;分子机制
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
病理学与病理生理学
陈杰;卢朝辉
2008
中文
R735.9;R730.21
110
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）