突变分析NHA2在酵母中的功能及其在哺乳动物细胞和小鼠中的表达作用研究
体外实验表明，钠-氢转运蛋白2(NHA2)高选择性地表达于破骨细胞，在破骨细胞分化、成熟、凋亡、骨吸收等过程中发挥重要作用。在对其细菌同源物NhaA进行的突变研究分析表明，有一些氨基酸残基对NHaA功能起着关键的作用，这些位点在进化上非常保守，不仅在细菌Nha中很重要，在真核生物NHA2中也起着非常重要的作用。
我们首先采用对盐敏感型的酿酒酵母Saccharomjrces cerevisiae BW3 la菌株来异源表达人源钠-氢交换蛋白2(HsNHA2)及其一系列突变体。用不同NaCI浓度的YNB固体琼脂平板和YNB液体培养基来研究表达HsNHA2及其突变体的酵母细胞表型生长特征，找出对HsNHA2盐离子载体发挥作用的关键位点，为我们进一步认识破骨细胞维持内外离子浓度的平衡机制打下基础。继而我们用细胞因子RNAKL来诱导RAW246.7细胞株分化成破骨样细胞；用RANKL和M-CSF联合作用诱导人外周血CD14+分化为成熟破骨细胞，来分别检测分析在诱导的不同阶段，NHA2的表达发生的变化，从而说明NHA2在破骨细胞正常分化成熟中所起的作用。最后我们用NHA2基因敲除小鼠模型，观察小鼠在没有NHA2表达的情况下生长表型会发生的变化。从而来揭示NHA2在高等生物正常生长中所起的作用。
我们发现HsNHA2278和279位点的精氨酸残基任何一个突变都会完全使BW3la菌株失去了耐受盐的功能，说明这两个残基对HsNHA2发挥离子载体功能至关重要。而F357和F437位点的双突变会使酵母不能在0.4MNaCl的溶液中生长，表明这些残基也是对其盐载体功能是非常重要的。G2-V187和S107-L115位点的任何一个缺失突变都使得菌株不能存活于0.2MNaCl中，表明这些区域对NHA2的功能都是必须的。从D278C和D279C单突变能部分地互补其功能来看，NHA2可能会形成二聚体来行使其离子转运功能。用破骨细胞体外分化系统，我们发现在细胞因子RANKL诱导RAW264.7成破骨细胞的不断成熟的过程中，NHA2表达不断增高。NHA2可在诱导2天后检测出来,5天后达到顶峰，说明NHA2表达在破骨细胞分化晚期。NHA2基因敲除小鼠生长表型与野生型差异不显著，但在体外提取骨髓诱导成破骨细胞过程中，NHA2基因敲出小鼠骨髓细胞分化成破骨细胞的能力比野生型弱，说明NHA2在一定程度上作用于破骨细胞，影响其正常分化成熟。
总之，我们的发现为转运机制的研究提供了除NHE和NhaA之外的的另一个很好的模板。NHA2作为一种不太被人了解的、但广泛存在的CPA2载体家族，不管在植物界还是动物界都发挥着重要功能。从整个实验看来，遗传上保守的氨基酸残基对NHA2完整的转运功能是必须的，对这些残基的任一突变都有可能影响NHA2的正常功能，从而影响破骨细胞功能，进而破坏整个机体平衡系统。
钠-氢转运蛋白2;酵母细胞;生长特征;基因敲除;离子载体
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
放射医学
樊飞跃;Ricardo A.Battaglino;Gregory Stephanopoulos
2010
中文
Q253;Q786
118
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）