TGF-β1信号通路和Wnt信号通路阻断对大鼠心梗后心肌纤维化过程的调控
心肌梗死(myocardial infarction，MI)是因冠状动脉或其分支阻塞而引起的缺血性心肌病，可导致心室重构，并可逐步进展为心力衰竭(heart failure，HF)，严重威胁人类的健康和生命。心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是最具特征性的结构改变之一，为MI后心室重构的主要表现之一，可促进心肌收缩和舒张功能失调。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)的长期激活，即增强的细胞增殖、肌成纤维细胞分化和伴随的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分泌，可导致心肌纤维化。
转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是最重要的促纤维化生长因子，为诸多因素所致MF的共同通路。MI后TGF-β1的表达显著性升高；而体内基因转染TGF-β1可诱导MF。为深入了解TGF-β1信号通路抑制对MI后MF过程的调控机制，本研究首先从细胞水平探讨了该信号通路抑制与CFs的生物学效应之间的关系。
培养新生大鼠的CFs，随机分为四组：PBS组、TGF-β1组、可溶性转化生长因子-β1Ⅱ型受体（soluble transforming growth factor-β1 receptorⅡ，sT3RⅡ）组和TGF-βl+sTβRⅡ组。MTT法检测CFs的增殖。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫细胞化学染色检测肌成纤维细胞分化。免疫细胞化学染色和Western blot分析检测TGF-β1信号通路中关键的信号分子P-Smad2和Smad2/Smad3蛋白的表达水平。结果表明，与PBS组相比较，TGF-βl组CFs的增殖、肌成纤维细胞分化和P-Smad2蛋白的表达均显著性升高（P＜0.01）；与TGF-1β组相比较，TGF-β1+sTβRII组CFs的增殖、肌成纤维细胞分化和P-Smad2蛋白的表达均显著性降低(P＜0.01)；各组间Smad2/Smad3总蛋白的表达水平无显著性差异(P＞0.05)。以上结果提示，TGF-β1可激活Smad信号，诱导CFs的增殖和肌成纤维细胞分化；sTβRⅡ预处理可抑制TGF-β1诱导的Smad信号的激活和下游事件，即CFs增殖和肌成纤维细胞分化，从而抑制CFs的功能。
此外，Wnt信号通路是脊椎动物发育过程中起关键作用的信号通路之一，参与了胚胎心脏的发育过程。而心脏病理过程中胚胎基因的重新表达是一种被普遍观察到的现象。研究表明，Wnt信号通路参与了MI后的组织修复过程。为深入了解Wnt信号通路抑制对MI后MF过程的调控机制，本研究进而探讨了该信号通路抑制与CFs的生物学效应之间的关系。
培养新生大鼠的CFs，随机分为四组：PBS组、Wnt-1组、分泌型卷曲相关蛋白-1（secreted frizzled related protein-1，sFRP-1）组和Wnt-1+sFRP-1组。MTT法检测CFs的增殖。α-SMA免疫细胞化学染色检测肌成纤维细胞分化。免疫细胞化学染色和Western blot分析检测Wnt信号通路中的两个关键性信号分子dishevelled-l（DVL-1）和β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。结果表明，与PBS组相比较，Wnt-1组CFs的增殖、肌成纤维细胞分化、DVL-1和β-catenin的表达均显著性升高(P＜0.01)；与Wnt-1组相比较，Wnt-1+sFRP-1组CFs的增殖明显降低(P＜0.05)、肌成纤维细胞分化、DVL-1和β-catenin的表达均显著性降低(P＜0.01)。以上结果提示，Wnt-1可激活Wnt信号通路，诱导CFs增殖和肌成纤维细胞分化；而sFRP-1预处理可拮抗Wnt-1的作用，抑制Wnt信号通路的激活和下游事件，即CFs增殖和肌成纤维细胞分化，抑制CFs的生物学功能。
为了进一步阐明TGF-β1信号通路和Wnt信号通路阻断对MI后MF过程的调控机制，我们通过结扎大鼠左冠状动脉前降支制作MI模型,4天后存活的大鼠随机进行处理并分组：假手术组（给予等量PBS，n=10）、MI组（给予等量PBS，n=10）、MI+sTβRⅡ组（在梗死区和梗死边缘区注射100ng sTpRⅡ/20μ1PBS，n=10）、Ml+sFRP-1组（在梗死区和梗死边缘区注射100ng sFRP-1/20μlPBS，n=10）和Ml+sTβRⅡ+sFRP-1组(给予100ng sTβRⅡ/10μlPBS和100ng sFRP-1/10μlPBS,n=10)。2周后,4只/组大鼠被处死，冰冻切片，α-SMA免疫组化染色检测肌成纤维细胞分化；4周后，测量血流动力学指标评价心功能，并计算重量参数和梗死面积。结果表明，与Ml组相比较，Ml+sTβRⅡ、Ml+sFRP-1和MI+sTβRⅡ+sFRP-1组肌成纤维细胞分化显著性减少(P＜0.01)，左心室收缩压明显升高、左心室末期舒张压明显降低、左心室最大变化速率明显升高(P＜0.01)，心脏重/体重、左心室重/体重明显减轻(P＜0.05)，梗死面积显著性减少(P＜0.05)。而MI+sTβRⅡ+sFRP-1组的变化最为显著。以上结果提示，联合应用sTβRⅡ和sFRP-1同时阻断TGF-β1信号通路和Wnt信号通路，可抑制肌成纤维细胞分化，有效缓解MF和左心室重构，改善缺血性心肌功能。
综上所述，本研究从体内和体外两方面证实了TGF-β1和Wnt信号通路阻断对心梗后MF过程的调控，为将来可能进行的临床干预提供了新的思路。
TGF-β1信号通路;Wnt信号通路;心肌纤维化;调控机制;病理特征
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
人体解剖与组织胚胎学
许增禄;张晓东
2010
中文
R542.220.2;R361.3
99
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）