重组载脂蛋白的A-I及其半胱氨酸突变体的功能研究
第一部分：重组载脂蛋白A-I半胱氨酸突变体N74C对apoE-/-小鼠颈总动脉套环诱导斑块和血管重塑的抑制作用
大量的动物实验和流行病学调查表明血浆高密度脂蛋白(HDL)及其主要蛋白成分-载脂蛋白A-I(apoA-I)的含量与冠脉疾病的发生呈负相关，是冠心病和动脉粥样硬化(As)最为重要的保护因素之一。成熟型apoA-I最显著的特征是含有8个22个氨基酸和2个11个氨基酸组成的串联重复序列，重复序列之间被脯氨酸隔开。ApoA-I的天然半胱氨酸突变体apoA-IMilan。(apoA-IM)和apoA-IPari。均表现出增强的心血管保护活性。ApoA-IM和apoA-IPui。突变位点分别位于螺旋6和螺旋5的双性α螺旋亲-疏水性交界面上，突变位点在多肽链位置上恰好相隔22个氨基酸残基。根据突变发生的特殊位置，我们实验室设计并构建了七种半胱氨酸突变体：A-I(S52C)，A-I(N74C),A-I(K107C),A-I(G129C),A-I(R173C),A-I(K195C)及A-I(S228C),并对其单体的二级结构稳定性、脂质结合能力、体外抗氧化和促胆固醇流出等功能进行了研究。在脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症小鼠动物模型中，与野生型apoA-I(wide type apoA-I，apoA-Iwt)和apoA-IM相比，A-I(N74C)突变体静脉注射显著抑制炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的表达和内毒素诱导的肺组织损伤。
实验目的：
本研究利用pET原核表达和纯化的重组载脂蛋白apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM，采用颈总动脉套环的apoE-/-小鼠作为动物模型，通过与apoA-Iwt和apoA-IM进行比较，探讨A-I(N74C)半胱氨酸突变体对小鼠颈动脉粥样硬化和血管重塑的保护作用及可能机制，并为我们深入理解apoA-I结构与功能的关系奠定基础。
实验方法：
利用pET原核表达系统对重组载脂蛋白apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM进行表达，快速蛋白质液相色谱系统(AKTA FPLC System)对目的蛋白进行纯化，获得高纯度的重组蛋白(＞90％)用于后续实验研究。纯化后apoA-lwt，A-I(N74C)和apoA-IM蛋白经Pierce亲和柱去除重组蛋白内残量内毒素，鲎试剂法检测内毒素合格后与大豆卵磷脂包装形成重组高密度脂蛋白(rHDL)：rHDLwt，rHDL74和rHDLmilano。利用铜离子介导的低密度脂蛋白(LDL)氧化系统和硫代巴比妥酸反应物(TBARS)分析法检测apoA-Iwt及其半胱氨酸突变体A-I(N74C)和apoA-IM的体外抗LDL氧化能力；将重组载脂蛋白与THP-1来源的巨噬细胞共同孵育培养，分别利用油红O染色和脂质抽提法分析A-I(N74C)半胱氨酸突变对氧化LDL(oxLDL)的巨噬细胞吸收和细胞内脂质累积的影响；28只雄性apoE-/-小鼠颈动咏套环快速、定点诱导颈部动脉粥样硬化和血管重塑；颈动脉套环apoE-/-小鼠随几分为五组：生理盐水对照组(0.3ml;n=5)、磷脂对照组(134mg/kg;n=5)、rHDLwt组（40mg/kg；n=6）、rHDL74组(40mg/kg；n=6)和rHDLmilano组(40mg/kg；n=6)。各组动物颈动脉套环后5天给予生理盐水、磷脂和rHDLs尾静脉注射，每隔10天注射一次，共三次。最后一次注射后24小时，摘眼球取血，分离血清，采用酶法测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和HDL胆固醇(HDL-C)含量；血清铁还原能力分析法(FRAS)检测apoE-/-小鼠血清总抗氧化能力；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎症因子IL-6的含量；apoE-/-小鼠固定，PBS灌流，取双侧颈总动脉置于10％中性缓冲福尔马林中固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色，光镜观察rHDL74静脉注射对颈As面积、内中膜比值和斑块内脂质含量的影响；利用大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，免疫组化检测小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞的含量。
实验结果：
体外抗LDL氧化实验：与apoA-lwt相比，重组蛋白A-I(N74C)和apoA-IM显著抑制铜离子介导的LDL氧化，并且A-I(N74C)和apoA-IM的抗氧化活性相似。为了排除A-I(N74C)的抗氧化作用与半胱氨酸突变引入游离巯基的关系，我们在反应体系中加入与apoA-Iwt摩尔浓度相同的还原型谷胱甘肽(GSH)。重组蛋白apoA-Iwt、A-I(N74C)和apoA-IM的半数抑制浓度(IC50)分别达到264、72和67μg/ml，而apoA-lwt+GSH组的半数抑制浓度降为238μg/ml。
细胞内脂质累积实验：油红O染色结果显示apoA-lwt组巨噬细胞内脂质累积面积比对照组减少30.65％，而A-I(N74C)和apoA-IM组分别减少56.78％和61.08％。有机溶剂抽提细胞内脂质，A-I(N74C)和apoA-IM组细胞内脂质含量比apoA-Iwt组显著降低，与油红O染色结果相一致。提示重组蛋白A-I(N74C)能够抑制oxLDL的细胞吸收和降低细胞内脂质累积，其抑制作用与apoA-IM相似。
体内动物实验：rHDL74静脉注射显著降低血清TC和非HDL-C水平，其降血脂作用与rHDLwt组相似，低于rHDLmilano组；与rHDLwt和rHDLmilano组相比，rHDL74给药组apoE-/-小鼠血清总抗氧化能力显著升高；rHDLwt静脉注射24小时后，血清IL-6水平升高至315.0±32.5pg/ml。与rHDLwt组相比，rHDLmilano和rHDL74静脉注射分别使小鼠血清IL-6水平降低17％和32％，达到261.5±35.2pg/ml和215.6±19.4pg/ml。提示rHDL74具有比rHDLwt和rHDLmilano更强的抗炎和抗氧化功能；与rHDLwt组相比，rHDL74静脉注射显著降低颈动脉粥样硬化斑块面积和血管内中膜比值、减少斑块内脂质和巨噬细胞含量，其体内抗As和血管重塑作用与rHDLmilano相似。
结论：
1.A-I(N74C)半胱氨酸突变能够增强重组蛋白的体外抗LDL氧化能力，其抗氧化功能与apoA-IM相似。A-I(N74C)突变体抗氧化活性的增强并不仅是半胱氨酸突变引入游离巯基的结果，可能与突变体本身结构和功能的改变以及突变体蛋白与反应底物之间的相互作用有关。
2.A-I(N74C)半胱氨酸突变能够抑制oxLDL的巨噬细胞吸收和降低细胞内脂质累积，其抑制作用与apoA-IM相似。结合以前胆固醇流出实验和体内血脂分析结果，提示A-I(N74C)降低细胞内脂质累积作用不是通过促进细胞内胆固醇流出过程，而是通过抑制LDL的氧化和oxLDL的细胞吸收。
3.与rHDLwt和rHDLmilano组相比，rHDL74静脉注射显著降低血清IL-6水平和增强血清总抗氧化能力，提示A-I(N74C)半胱氨酸突变能够显著增强重组蛋白的体内抗炎和抗氧化能力。
4.与rHDLwt组相比，rHDL74静脉注射显著降低apoE-/-小鼠颈As斑块面积和血管内中膜比值、减少斑块内脂质和巨噬细胞含量，其抗As和血管重塑作用与rHDLmilano相似。
5.A-I(N74C)半胱氨酸突变体的抗As和血管重塑功能可能是来源于突变体蛋白增强的抗炎和抗氧化活性，而不是对胆固醇逆转运过程的促进功能。
第二部分：重组高密度脂蛋白作为药物载体的抗肿瘤实验研究
癌症（恶性肿瘤）是对人类健康危害最严重的疾病之一。目前大多数化疗药物仍存在不同程度对靶细胞的选择性或药物耐受性差、毒副作用强、水溶性不足等缺陷，使抗肿瘤药物在靶细胞中难以达到发挥治疗作用的有效浓度。HDL是人体内体积最小、密度最高的脂蛋白，具有独特的亲水性.疏水性结构、内源性可完全降解以及不被网状内皮系统识别和清除等多种作为药物载体的特性。以HDL作为药物载体，可以通过受体介导的机制促进药物的细胞吸收。在HDL与受体的结合过程中，HDL的主要蛋白质成分apoA-I发挥关键作用。成熟型apoA-I最显著的特征是含有8个22个氨基酸和2个11个氨基酸组成的串联重复序列，重复序列之间被脯氨酸隔开。ApoA-IM和apoA-IParis是apoA-I的天然半胱氨酸突变体，其突变体携带者表现为增强的心血管保护活性。ApoA-IM和apoA-IPali。突变位点分别位于螺旋6和螺旋5的双性α螺旋亲、疏水性交界面上，突变位点在多肽链位置上恰好相隔22个氨基酸残基。根据突变发生的特殊位置，我们实验室设计并构建了七种半胱氨酸突变体：A-I(S52C),A-I(N74C),A-I(K107C),A-I(G129C),A-I(R173C),A-I(K195C)及A-I(S228C)，并对其结构和功能进行了研究。
实验目的：
本研究利用pET原核表达和纯化的重组载脂蛋白apoA-Iwt及7种apoA-I半胱氨酸突变体，流式细胞术挑选出受体结合力最高的半胱氨酸突变体apoA-IM用于构建药物载体。通过与10-羟基喜树碱(HCPT)、普通药物脂质体和rHDLwt-HCPT药物脂质体进行比较，重点观察rHDLM-HCPT药物脂质体对包封药物体外释药、体内组织分布和体外抗肿瘤活性的影响，探讨rHDLM作为药物载体对抗肿瘤药物HCPT水溶性、缓释作用、组织分布和细胞毒性等的改善作用，进一步探索利用apoA-I突变体或模拟肽作为药物载体的可行性。
实验方法：
pET原核表达和纯化重组蛋白apoA-Iwt及7种半胱氨酸突变体。异硫氰酸荧光素(FITC)标记重组载脂蛋白，流式细胞术检测不同部位半胱氨酸突变对apoA-I受体结合力的影响，选择受体结合力增强的apoA-IM突变体制备药物载体。分别利用apoA-Iwt和apoA-IM重组蛋白，按照不同药脂比薄膜分散法制备rHDL-HCPT药物脂质体：rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT，并分析不同药脂比对药物脂质体包封率的影响。按照包封率最高的药脂比制备药物脂质体，分别利用磷脂测定试剂盒、BCA法和分光光度法检测药物脂质体内的磷脂、蛋白和HCPT药物的含量，分析药物脂质体内的成分组成和有效载药率。透射电镜观察rHDL-HCPT药物脂质体的形态，软件计算药物脂质体的平均直径。采用1％、3％、5％蔗糖和5％、10％、15％每藻糖作为冷冻干燥保护剂，观察不同冻干保护剂对药物脂质体药物渗漏和脂质过氧化的保护作用。体外释药实验观察游离HCPT、普通药物脂质体、rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT药物脂质体的体外释药曲线。尾静脉注射10mg/kg游离HCPT和rHDLM-HCPT药物脂质体，静脉注射后0.5、1、3、5、24小时，摘眼球取血，分离血浆。取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织，称重后组织匀浆，荧光法检测血浆和各组织匀浆内HCPT药物含量。利用SKOV-3和HCT-116癌细胞，通过与游离HCPT、普通药物脂质体和rHDLwt-HCPT药物脂质体进行比较，观察rHDLM-HCPT药物脂质体对HCPT细胞毒性的增强作用。
实验结果：
受体结合力分析：与apoA-Iwt相比，apoA-IM突变体的相对受体亲和力显著升高，而A-I(S52C)、A-I(K107C)和A-I(G129C)突变体蛋白的相对受体亲和力显著降低。载脂蛋白A-I(N74C)、A-I(K195C)和A-I(S228C)半胱氨酸突变蛋白的受体亲和力未见明显影响。
药物脂质体的制备：药脂比为1:20时可以获得最大药物包封率。rHDLM-HCPT药物脂质体内磷脂成分占65.15％，apoA-I成分占30.54％，载药量达到4.31％。制备完成的rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT药物脂质体颗粒绝大多数呈圆球形，直径分别为25.36±10.47mn和22.39±10.25nm，与体内天然存在的HDL相似。利用3％蔗糖作为冻干保护剂可以有效保护药物脂质体的药物渗漏和脂质过氧化。体外释药实验：rHDLwt-HCPT和rHDLM-HCPT药物脂质体体外释药表现为稳定缓释曲线。游离HCPT、普通药物脂质体和rHDLwt-HCPT药物脂质体24小时累积释药量分别达到90.7％、65.％和41.3％，而rHDLM-HCPT药物脂质体仅有26.9％的药物释出。
体内组织分布：游离HCPT静脉注射后药物主要分布在肝、肾和血浆中，但最高药物浓度均不超过7μg/g组织。与游离HCPT相比，rHDLM-HCPT药物脂质体静脉注射半小时使肝、肾和脾脏的药物浓度分别增加5.5、15.4和32.3倍，肺脏和血浆药物浓度增加1.8倍和1.3倍。游离HCPT静脉注射5小时后，血浆内几乎检测不到HCPT存在，而rHDLM-HCPT药物脂质体静脉注射24小时后，血浆药物浓度仍维持在0.421μgGHHCPT/ml。同时，rHDLM-HCPT药物脂质体静脉注射24小时后，其肝、肾、脾和肺脏药物浓度比游离HCPT静脉注射分别升高2.2-5.7倍。
体外抗肿瘤活性：与游离HCPT相比，普通药物脂质体和rHDLwt-HCPT分别使药物对SKOV-3细胞的IC50降低27倍和58倍，而rHDLM-HCPT则降低70倍。与游离HCPT和普通药物脂质体相比，rHDLM-HCPT作为药物载体使HCPT药物对HCT-116细胞的IC50分别降低50倍和10倍。即使与rHDLwt-HCPT相比，rHDLM-HCPT对HCT-116细胞的IC50仍然降低30％左右。
结论：
1.ApoA-I不同部位半胱氨酸突变对受体亲和力的影响不同。ApoA-IM突变体比apoA-lwt显著升高的受体亲和力使其更适宜于药物载体的制备。
2.选择apoA-IM突变体制备药物载体，薄膜分散法制备rHDLM-HCPT药物脂质体。当药脂比为1:20时，rHDLM-HCPT药物脂质体的包封率达到最高，载药率为4.31％。薄膜分散法制备完成的药物脂质体绝大部分呈圆球形，直径与天然HDL相似。
3.冷冻干燥可以减少药物脂质体内药物渗漏和脂质过氧化。利用3％蔗糖作为冻干保护剂可以有效发挥对药物脂质体的保护作用。
4.rHDLM作为药物载体使HCPT药物体外释药呈现稳定缓释曲线，其缓释作用显著强于游离HCPT、普通药物脂质体和rHDLwt-HCPT药物脂质体。
5.与游离HCPT相比，rHDLM作为药物载体可以显著增强HCPT在血浆、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等主要器官的药物浓度，并且延长药物浓度的维持时间。
6.rHDLM作为药物载体可以显著增强HCPT对SKOV-3卵巢癌细胞和HCT-116结肠癌细胞的细胞毒性。综上说述，利用rHDLM作为药物载体可以显著改善抗肿瘤药物HCPT水溶性不足、半衰期短、组织分布特异性和选择性差的缺陷，并且增强药物的体外抗肿瘤活性。rHDLM作为药物载体对药物物理化学性质和体外抗肿瘤活性的改善作用表明利用apoA-I突变体或模拟肽作为药物载体的尝试具有可行性。然而，rHDLM作为药物载体对抗肿瘤药物的组织选择性、药物浓度维持和抗肿瘤活性的影响还需要进一步在体内进行验证。
第三部分：不同比例载脂蛋白A-I与载脂蛋白A-V重组脂质体对其结构和功能的影响
载脂蛋白A-V（apolipoprotein A-V，apoA-V）是2001年通过对人类和小鼠DNA基因组比对分析中偶然发现的载脂蛋白家族新成员。ApoA-V转基因小鼠和基因敲除小鼠研究表明apoA-V具有调节血浆TG代谢的功能，与人体内TG的代谢和清除密切相关。ApoA-I是HDL的主要蛋白质成分，在胆固醇代谢和抗As中发挥关键作用。ApoA-I与apoA-V基因都位于人11号染色体长臂2区3带的apoA-I/CIII/AIV/AV基因簇中，此基因簇中表达的多个基因均在胆固醇和甘油三酯代谢过程中发挥重要作用。尽管apoA-V在体内含量很低，大多数apoA-V在体内存在于HDL中，并且可以迅速从HDL向VLDL进行转移。同时，apoA-V在体内过表达能够影响HDL的含量和成熟过程。尽管目前已经发现apoA-V蛋白与HDL之间可能存在某种相关性，apoA-V对HDL结构和功能的影响仍知之甚少。
实验目的：
原核表达和纯化的apoA-V和apoA-I蛋白，利用不同比例的apoA-V和apoA-I重组蛋白，胆酸钠透析法制备rHDL。通过对rHDL的形态结构以及脂质结合能力、体外抗氧化、细胞内脂质累积、LPL激活和VLDL清除等apoA-I和apoA-V相关功能的检测，观察rHDL内不同比例apoA-V对rHDL结构和功能的影响。我们希望对这些问题的研究和揭示能够对我们更深入、更全面的了解apoA-V的功能及作用机制有所帮助。
实验方法：
利用pET原核表达系统对重组蛋白apoA-lwt进行表达，快速蛋白质液相色谱系统对目的蛋白进行纯化。原核表达和纯化apoA-V重组蛋白，725mM胆酸钠或50mM柠檬酸钠溶液(pH3.0)溶解用于后续实验。利用不同比例的apoA-V和apoA-I重组蛋白，胆酸钠透析法制备rHDL。分别利用磷脂测定试剂盒和BCA法检测重组脂质体中磷脂和蛋白含量，分析制备前后重组脂质体中磷脂/蛋白比值的改变情况。DMPC浊度澄清实验分析不同比例apoA-V和apoA-I蛋白混合物的脂质结合能力。透射电镜观察负染rHDL的形态，Image Proplus 6.0软件计算rHDL的平均直径。利用体外铜离子介导的LDL氧化系统和TBARS分析法检测rHDL的体外抗LDL氧化能力；利用THP-1来源的巨噬细胞分析rHDL对oxLDL的巨噬细胞吸收和细胞内脂质累积的影响；体外LPL激活实验用于分析rHDL内apoA-V对LPL活性的激舌作用；利用HepG2细胞观察rHDL内apoA-V对荧光标记VLDL的细胞吸收和清余的影响：利用雄性BALB/c小鼠，体内观察rHDL内apoA-V对血浆内Dil-VLDL青除的影响；将含apoA-V的rHDL与VLDL在37℃条件下共同孵育30min,密度弟度离心分离VLDL，观察rHDL内apoA-V从rHDL向VLDL的转移。
实验结果：
rHDL的制备：原核表达和纯化apoA-I和apoA-V蛋白，采用不同比例的apoA-I阳apoA-V重组蛋白，胆酸钠透析法制备形成六种rHDL:AI-rHDL，AV-rHDL，(1:1)-rHDL，(10:1)-rHDL，(100:1)-rHDL和(1000:1)-rHDL。SDS-PAGE电泳鉴定重组脂质体内apoA-I和apoA-V的质量比与加入初始比例相一致。随着apoA-V含量的噌加，rHDL内磷脂/蛋白比值逐渐升高。DMPC浊度澄清实验证实apoA-V的脂质结合能力略高于apoA-I。透射电镜结果表明随着rHDL内apoA-V含量的增加，rHDL的平均直径逐渐增大，这可能是由于apoA-V比apoA-I增强的脂质结合能力使apoA-V含量更高的rHDL可以结合更多的脂质，从而导致rHDL体积的增加。
体外抗LDL氧化实验：随着rHDL内apoA-V含量的增加，rHDL的体外抗氧化活性逐渐增强。为了进一步验证apoA-V的抗氧化活性，我们在相同量AI-rHDL的基础上，加入不同量的AV-rHDL，结果随着AV-rHDL含量的增加，重组脂质体混合物的抗氧化活性逐步增加，表明rHDL内apoA-V成分可以增强rHDL的抗氧化活性。脂质游离型apoA-V在体外同样表现出明显的抗氧化活性，其抗氧化活性低于脂质结合型。
细胞内脂质累积实验：AI-rHDL能够显著抑制oxLDL的细胞吸收和细胞内月旨质累积。然而，随着rHDL内apoA-V含量的升高，THP-1来源的巨噬细胞内脂质累积显著增加。
LPL激活实验：rHDL内apoA-V含量的增加不仅没有增强LPL的水解活性，反而抑制LPL引发的TG水解作用。将含apoA-V的rHDL与VLDL共同孵育30min后，再加入其它反应物质进行反应，结果仍没有增加apoA-V的LPL激活活性。体内外VLDL清除实验：随着rHDL内apoA-V含量的增加，VLDL的细胞吸收和体内清除逐渐减少。在给予rHDL之前静脉注射硫酸鱼精蛋白以抑制血浆LPL的活性，结果在LPL活性被抑制的情况下，血浆内VLDL的清除被完全抑制，表明LPL对于VLDL的体内清除是至关重要的。
ApoA-V转移实验：将含有apoA-V的rHDL与VLDL共同孵育后，VLDL内的apoA-V浓度未见明显升高，表明apoA-V没有发生从rHDL向VLDL的转移。
结论：
1.利用不同比例重组apoA-V和apoA-I蛋白，胆酸钠透析法制备rHDL。由于apoA-V比apoA-I增强的脂质结合能力，制备完成的rHDL随着apoA-V含量的增加，其磷脂/蛋白比值和直径逐渐增大。
2.体外抗LDL氧化实验表明，apoA-V重组蛋白具有抗LDL氧化活性。rHDL内apoA-V增强的抗氧化活性可能与apoA-V本身抗氧化功能或apoA-V与apoA-I和磷脂之间的相互作用有关。
3.ApoA-V和apoA-I重组脂质体内apoA-V成分对oxLDL的巨噬细胞吸收和细胞内脂质累积没有作用，其活性取决于rHDL内的apoA-I成分。
4.ApoA-V和apoA-I重组脂质体内apoA-V体外对LPL活性没有激活作用。随着rHDL内apoA-V含量的升高，rHDL反而抑制反应体系内LPL的TG水解活性。
5.在体内外VLDL清除实验中，apoA-V和apoA-I重组脂质体内apoA-V均未促进VLDL的清除。血浆LPL对于体内VLDL的清除至关重要。
6.在37℃孵育条件下，rHDL内的apoA-V不能从rHDL转移至VLDL中。
7.rHDL内apoA-V对体外LPL激活和体内外VLDL清除的失活，可能是由于rHDL内的apoA-V不能从rHDL转移至VLDL，而与rHDL结合的apoA-V与反应体系内LPL结合而抑制LPL活性的发挥，从而导致LPL活性和体内外VLDL清除的抑制。
载脂蛋白A-I;半胱氨酸突变体;血管重塑;冠脉疾病;原核表达;抗氧化活性
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
生物化学与分子生物学
陈保生
2010
中文
R541.402;R361.3
160
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）