AML1a在小鼠造血细胞增殖分化异常中的作用
细胞的增殖分化受到严格调控，转录因子协调细胞中多种基因的表达是其中重要的调控机制。造血细胞的增殖失控、分化能力的丧失将可能导致细胞的恶性转化及白血病的发生。因此，阐明转录因子的功能对于确定细胞增殖分化调控机制以及在细胞恶性转化中的作用具有重要意义。AML1也称之为PEBP2αB、CBFα2或RUNX1，是一种重要的转录调节因子。它在造血细胞中普遍表达，调节造血细胞的分化和增殖。
RUNX1/AML1通过选择性剪接产生至少三种异构体：AML1a、AML1b和AML1c。其中，AML1b与AML1c仅在氨基末端存在27个氨基酸残基的差异，均具有两个主要的功能结构域：DNA结合结构域和转录激活结构域，两者的功能基本相同，即我们通常所说的AML1。AML1a具有DNA结合结构域，但缺少转录激活结构域，因此通常被认为不具有转录激活功能，但由于其具有DNA结合结构域，可以与AML1b/1c竞争结合靶基因的DNA结合位点，导致靶基因不能正常转录，提示AML1a可能干扰AML1的转录调节功能。有证据表明，AML1a在急性髓系白血病(AML)中表达高于正常对照。我们的前期实验也已证实AML1a在急性白血病(AL)中的高表达，而且，AML1a可以抑制由AML1b介导的M-CSF受体(M-CSFR)启动子的转录，提示AML1a对AML1b具有拮抗作用。为了进一步研究AML1a在造血及白血病发病中的作用并探讨其作用机制，本文完成了下列研究工作：
1．AML1a表达载体的构建及病毒的制备
pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP质粒，将此质粒和pMSCV-IRES-YFP分别与辅助质粒pVPack-Eco（含Env）、pVPack-GP（含gal-pol）组合，通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞，制备逆转录病毒。病毒感染3T3细胞，检测病毒滴度，并测定AML1a的表达情况。结果显示在感染的细胞中证实有AML1a和YFP的表达，所制备的病毒滴度满足后续实验的要求。
2．AML1a在小鼠造血细胞增殖分化异常及恶性转化中的作用
1)C57雄性小鼠的骨髓单个核细胞(BMMNCs)通过逆转录病毒转导AML1a及空白对照后，置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的M5300液体培养基中进行培养，并接种于M3434甲基纤维素完全培养基进行集落形成实验。长期培养试验中，AML1a组细胞形态显示分化阻滞，而对照组细胞则处于更成熟的阶段。集落形成实验显示转导了AML1a的BMMNCs集落形成能力增强，集落体积明显大于对照组，集落构成方面以CFU-E和CFU-GEMM为主，提示AML1a阻滞小鼠造血干祖细胞于较早的发育阶段，并增加了造血干祖细胞的增殖能力。
2)将转导AML1a的C57小鼠的骨髓单个核细胞，尾静脉注射至致死剂量照射的C57雌性小鼠体内，单一转导YFP的小鼠作为对照。定期尾静脉取血，查血象及白细胞分类。转导AML1a的小鼠尚未出现典型的白血病表型。
综上所述，本研究通过逆转录病毒转导AML1a至小鼠BMMNCs中，发现AML1a可能将正常造血过程阻滞于较早期的祖细胞阶段，并使早期祖细胞的增殖活性增加。研究业已发现，AML1a在急性白血病中的表达水平升高，并使干祖细胞增殖活性升高，提示AML1a可能参与白血病发生中的分化异常，并有利于维持白血病干细胞的高增殖活性。
AML1a表达载体;逆转录病毒;白血病;分化异常;造血细胞增殖
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
硕士
病理学与病理生理学
王敏
2010
中文
R733.7
57
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）