2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐的神经保护作用及对AD转基因小鼠的作用
2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐的神经保护作用及对AD转基因小鼠的作用
2-（α-羟基戊基）苯甲酸钾盐(Potassium2-(1-hydroxypentyl)-benzoate，dl-PHPB）是中国医学科学院药物研究所研发的的新化合物，它是丁基苯酞的前药。以往的研究表明，dl-PHPB可改善缺血区脑血流，降低梗死体积。此外，dl-PHPB对慢性脑低灌注大鼠、Aβ诱导的痴呆及快速老化小鼠的学习和记忆障碍均有改善作用，为了进一步明确dl-PHPB的抗AD作用靶点，本研究观察了dl-PHPB的神经保护作用，并对dl-PHPB的抗AD作用机制进行了探讨。本工作分为以下几个方面：
第一部分:
2-（α-羟基戊基）苯甲酸钾盐对过氧化氢损伤的SK-N-SH细胞抗凋亡作用研究
凋亡是由基因调控的细胞自主性、程序性死亡。目前许多研究表明在神经退行性疾病和脑卒中病人的脑组织中存在大量神经元的凋亡，而氧化应激是引起神经元凋亡的主要原因。因此，能够抑制氧化应激所致凋亡的药物可能在治疗神经退行性疾病和脑卒中中有着很好的应用前景。为此，我们采用H2O2损伤模型，观察dl-PHPB的神经保护作用及其可能的机制。
我们首先评价了dl-PHPB对H2O2损伤的SK-N-SH细胞生存率和凋亡率的影响。利用MTT方法检测细胞生存率，结果显示，SK-N-SH细胞经H2O2150μM作用24h后，生存率显著低于正常对照组，dl-PHPB10μM处理组可显著提高细胞生存率。应用Hoechst33342荧光染色法检测细胞凋亡。结果显示，正常对照组细胞的凋亡率较低，经H2O2处理24h后细胞凋亡率明显升高，给予0.1、1、及1OμMdl-PHPB处理后，细胞凋亡率呈剂量依赖性下降，其中dl-PHPB1、1OμM剂量组的细胞凋亡率与模型组相比具有显著性差异。
为进一步了解dl-PHPB的抗凋亡作用机理，我们对凋亡相关基因的表达进行了测定。Real-TimePCR结果显示H2O2损伤24h后SK-N-SH细胞中Bax基因表达明显增加，Bcl-w表达显著下降，给予dl-PHPB1OμM处理的细胞其Bax基因表达明显下降，Bcl-w表达明显增加。Westernblot结果显示H2O2可明显下调Bcl-2的表达，对Bax、Caspase3的蛋白表达具有上调作用，dl-PHPB处理后可部分逆转以上作用，显示dl-PHPB抗凋亡作用与其调节凋亡相关基因的表达有关。
随后，我们对凋亡相关基因的上游信号通路PKCa的蛋白表达进行了测定。结果显示H2O2损伤24h后，PKCa的表达明显下降，给予dl-PHPB处理后，可显著上调PKCa的表达。
本部分研究提示dl-PHPB可能通过增加PKCα的表达而增加抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-w的表达，降低促凋亡基因Bax、Caspase3的表达而发挥其抗凋亡作用，PKC信号通路可能参与dl-PHPB的神经保护作用。
第二部分:
2-（α-羟基戊基）苯甲酸钾盐对APP/PS1转基因小鼠抗AD作用机制研究
细胞外由β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑和细胞内以过磷酸化的Tau蛋白为核心形成的神经元纤维缠结是阿尔茨海默病的的两大病理学特征，本研究采用APP/PS1转基因痴呆小鼠模型，重点观察了dl-PHPB对15月龄转基因小鼠皮层、海马中Tau蛋白、β-淀粉样蛋白及其相关调节酶的影响。
Westernblot结果显示，与同龄野生型小鼠相比，15月龄转基因小鼠皮层、海马中P-Tau(S396)、P-Tau(T205)位点的蛋白表达明显增高，给予dl-PHPB30mg/kg处理后可显著降低转基因小鼠皮层、海马中P-Tau(S396)、P-Tau(T205)位点的蛋白表达。在皮层中，P-Tau(S199)位点的蛋白表达在野生型与转基因小鼠中没有明显差别。转基因小鼠海马中的P-Tau(S199)蛋白表达显著高于同龄野生型小鼠，给予dl-PHPB处理后可显著降低该蛋白的表达。转基因小鼠P-Tau(S404)位点的蛋白表达在野生型与转基因小鼠皮层、海马中均没有明显差别，dl-PHPB对P-Tau(S404)位点的蛋白表达也无明显调节作用。
随后，我们对调节Tau蛋白磷酸化的主要蛋白激酶GSK-3p、CDK5及磷酸酶PP2A的蛋白表达进行了测定。结果表明，与野生型小鼠相比，转基因小鼠海马中P-GSK-3β(Y216)位点的蛋白表达明显增加，dl-PHPB可显著降低其表达。Tg小鼠皮层、海马中P-CDK5(S159)位点的蛋白表达均明显高于同龄野生型小鼠，dl-PHPB可显著降低Tg小鼠皮层、海马中P-CDK5(S159)位点的蛋白表达。与野生型小鼠相比，APP/PS1转基因小鼠皮层、海马中total-GSK-3β和total-CDK5的蛋白表达无明显改变，dl-PHPB对total-GSK-3β和total-CDK5的蛋白表达也无明显影响。P-GSK-3β(S9)、P-GSK-3α(Y279)及PP2A的蛋白表达在各组间亦无显著差别。
免疫组化结果显示，在15月龄APP/PS1转基因小鼠皮层及海马中均有大量β-淀粉样肽沉积，在皮层及海马中，dl-PHPB处理组与转基因组小鼠相比β-淀粉样肽的含量均无明显改变。与同月龄野生型小鼠相比，15月龄转基因小鼠皮层、海马中TBSsoluble、TBSTsoluble和Guanidinesoluble的Aβ1-42含量明显增加，dl-PHPB对三种形式的Aβ1-42含量均无明显影响。
Westernblot结果显示，与野生型小鼠相比，转基因小鼠皮层及海马中的P-APP(T668)位点的蛋白表达显著增加，给予dl-PHPB处理后可明显降低P-APP(T668)位点的蛋白表达。APP、α-APP、ADAM17及ADAM10的蛋白表达在野生型小鼠、转基因小鼠及dl-PHPB处理组小鼠皮层和海马中均无明显改变。
本部分研究提示dl-PHPB对Tau蛋白磷酸化的调节作用及对磷酸化APP的降低作用可能与其抗AD作用有关。GSK-3p和CDK5参与dl-PHPB对磷酸化Tau蛋白的调节作用。dl-PHPB对β-淀粉样肽的含量无明显调节作用。
第三部分：
2-（α-羟基戊基）苯甲酸钾盐对稳定转染APP695的SK-N-SH细胞中
Tau蛋白磷酸化的调节作用研究
Tau蛋白磷酸化诱导的神经元毒性被认为是阿尔茨海默病的重要病理机制之一，在本部分研究中，我们对稳定转染APP695的SK-N-SH细胞中磷酸化Tau蛋白Ser396、Thr205和Ser199位点的蛋白表达进行了测定，并评价了d1-PHPB对三种磷酸化Tau蛋白的含量影响。在此基础上重点观察了dl-PHPB对Tau蛋白磷酸化的主要蛋白激酶GSK-3β和CDK5的蛋白表达影响，以期阐明dl-PHPB的抗AD作用机理。
Westernblot结果显示，稳定转染APP695的SK-N-SH细胞中Ser396、Thr205和Ser199位点的Tau蛋白表达显著高于野生型SK-N-SH细胞，给予dl-PHPB处理后，可明显降低Ser396、Thr205位点的Tau蛋白表达。dl-PHPB对Ser199位点的Tau蛋白表达无明显影响。
对GSK-3β和CDK5的研究表明，dl-PHPB1μM可显著增加P-GSK-3β(S9)位点的蛋白表达。dl-PHPB0.1μM、1μM和10μM处理后均能不同程度抑制P-GSK-3p(Y216)、P-GSK3α(Y279)和P-CDK5(S159)位点的蛋白表达，但对totalGSK-33和CDK5的蛋白表达没有明显影响。以上对SK-N-SHAPP695细胞株中不同位点的Tau蛋白磷酸化水平的研究提示，dl-PHPB可能通过调节GSK-3β和CDK5的磷酸化水平而抑制Tau蛋白磷酸化，发挥其抗AD的作用。
2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐;氧化应激;阿尔茨海默病;神经退行性疾病;细胞凋亡;蛋白激酶C;神经保护;AD转基因
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
药理学
王晓良
2010
中文
R971;R745.1
119
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）