人心肌特异表达新激酶TNNI3K的大鼠同源基因克隆及相关腺病毒载体构建
研究背景与目的：
TNNI3K基因是人心肌特异表达的新激酶，进一步研究应在人心肌细胞中展开，但没有人源心肌细胞系可用，只有在乳鼠心肌细胞中，通过研究同源基因大鼠TNNI3K作为激酶到底通过哪条磷酸化通路参与心肌肥厚，来揭示人TNNI3K心肌特异表达的真正意义。面临的问题是，课题组尚无用于后续功能研究的大鼠TNNI3K基因克隆。因此，本研究的首要任务是克隆大鼠TNNI3K基因，筛选RNA干扰的有效靶点，构建该基因的过表达和RNA干扰腺病毒重组体，为在大鼠心肌细胞中研究TNNI3K参与心肌肥厚打下基础。
方法和结果：
1.生物信息学方法确认大鼠TNNI3K基因的序列。分段扩增大鼠TNNI3K基因片段，经酶切连接克隆到T/A载体中，经测序验证，得到大鼠TNNI3K基因的全部编码区。2.设计合成4个shRNA干扰片段，干扰质粒和重组表达质粒共转染工具细胞293T，WesternBlot和Real-timePCR方法分别检验干扰效率，筛选出rTNNI3K基因RNA干扰的有效靶点：+880～+898位，抑制效率达到90％，并构建了RNA干扰的腺病毒重组体。3.大鼠TNNI3K基因克隆到腺病毒的穿梭质粒中，通过同源重组，得到腺病毒TNNI3K重组体质粒，在293细胞中制备出腺病毒rTNNI3K重组体。4.WesternBlot的方法检测过表达和RNA干扰对乳鼠心肌细胞JNK、p38和Erk磷酸化水平的影响。初步的结果显示，无论是rTNNI3K过表达还是RNA干扰，都能激活JNK和p38信号通路，而对Erk通路没有影响。
结论：
本实验成功克隆到了序列正确的大鼠TNNI3K基因；筛选到能高效抑制大鼠TNNI3K基因表达的RNA干扰片段；制各得到滴度较高的TNNI3K基因过表达和RNA干扰腺病毒重组体，可以用于原代培养的心肌细胞，为今后深入研究TNNI3K在心肌细胞MAPK信号通路中的作用打下了坚实的基础。
T新激酶NNI3K基因;腺病毒表达载体;RNA干扰;MAPK信号通路;人心肌特异表达;同源基因克隆
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
硕士
生物化学与分子生物学
孟宪敏
2010
中文
R542.2
93
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）