非小细胞肺癌EGFR基因突变检测试剂盒的开发
背景与目的
Scorpions ARMS EGFR基因突变检测试剂盒，是目前公认检测EGFR基因突变最为敏感的方法之一，其检测灵敏性可达10copies，敏感性高达1％。此外它还具有操作简便、结果判读容易、省时、检测突变种类多等优点，但唯一缺点是价格昂贵，不适合象中国这种发展中国家NSCLC患者的常规检测和筛查。因此，本研究拟采用ARMS技术与Taqman探针楣结合的方法，研发一种拥有完全自主知识产权并且能够快速、敏感、特异、简便检测EGFR基因突变的试剂盒。
ScorpionsARMS试剂盒ARMS引物设计是将3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效扩增。但是对于替换突变，如T790M，在使用ARMS引物时，由于野生型与突变型只有一个碱基的差别，当野生型模板含量高时，可能发生无效的引物结合，由此产生非特异性扩增，导致检测出现假阳性结果。因此，我们拟重新设计ARMS引物，在引物的3’端再人为引入一个错配碱基，这样对野生型模板即有两个错配碱基，可大大提高特异性，而对突变型模板只有一个错配碱基，且不在3’末端，通过反复实验筛选，最终确定与突变模板具有高结合效率的引物，同时不影响检测灵敏度。
方法
①采用重叠延伸PCR法联合质粒连接、转化构建EFGR基因29种常见突变体（包括18外显子的3种突变G719A、G719S、G719C;19外显子的19种缺失突变；20外显子的5种突变T790M、S7681和3种插入突变；21外显子的2种突变L858R和L861Q，共29种）。
②应用PrimerExpress3.0软件设计EGFR基因29种常见突变的ARMS特异性引物以及用于目的序列检测的Taqman水解探针，通过反复实验筛选并确定最终的ARMS引物和Taqman探针，并优化反应体系：建立试剂盒。然后，以所构建的基因突变体为研究对象，进一步分析该试剂盒的检测灵敏度、敏感性以及确立特异性和非特异性扩增的Cutoff△Ct值。
③采用TaqmanARMS试剂盒检测100份NSCLC组织标本。其中有29份标本，曾采用ScorpionsARMS试剂盒检测过EGFR基因突变，通过比较这两种方法检测结果的差异，来评价这两种方法检测一致性。
结果
①采用重叠延伸PCR法能够对EGFR基因实施定点突变，联合质粒连接和DH5α感受态细胞转导能够成功重建29种常见的EGFR基因突变体。
②最终筛选和确定的ARMS引物和Taqman探针见第二部分表3。在无野生型基因以及背景DNA干扰的情况下，本试剂盒的检测灵敏度可达10copies。对于检测敏感性方面，在500copies/ul野生型基因背景下，其敏感性达1%，即混有1%突变基因即可检出；在5000copies/ul野生型基因背景下，其敏感性高达0.1-0.5%。对于检测特异性方面，以正常人白细胞DNA(1-50ng/ul)为研究对象，T790M和21L858R突变存在一定程度的非特异性扩增，但其最小△CT（CT非特异-CT内参）仍分别高达11.36和14.89，而其他的突变G719X、19Del、20Ins、L861Q、S768I均未见非特异性扩增。
③100份临床标本，TaqmanARMS试剂盒检出19Del21例，21L858R18例，20Ins1例．G719X1例，总突变率为41.0%(41/100)。从EGFR基因突变分布看，19Del占51.2%(21/41)，21L858R占43.9%(18/41)，20Ins占2.4%(1/41)，G719X占2.4%(1/41)，未检出T790M突变。其中29份标本分别采用了ScorpionsARMS和TaqmanARMS进行检测，两种方法对19Del突变检出一致率为93.1%，Kappa值为0.627;对21L858R突变检出一致率高达96.6%，Kappa值为0.890，两种方法具有较高的一致性。
结论
我们所设计的TaqmanARMS荧光定量PCR试剂盒是一种快速、简便、经济以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法，值得在临床上进一步验证和推广。
第一部分，29种EGFR基因突变体的构建
目的：采用重叠延伸PCR法联合质粒连接、转化构建EFGR基因29种常见突变体。
方法：首先，采用重叠延伸PCR法建立EGFR基因常见的29种突变（包括18外显子的3种突变G719A、G719S、G719C;19外显子的19种缺失突变；20外显子的5种突变T790M、S7681和3种插入突变；21外显子的2种突变L858R和L861Q，共29种）；其次，将建立的29种突变型EGFR基因分别与pMD19载体进行连接反应，连接产物与DH5α感受态细胞悬液进行转化反应，然后将转化产物接种至含Amp的固体培养基中进行培养，白色菌斑表示基因插入成功，蓝色菌斑表示插入不成功；最后，挑选白色单克隆菌斑加入到LB液体培养基中培养，并进行PCR鉴定以及测序鉴定以判断是否成功构建EGFR基因突变体。
结果：第一轮PCR结果显示，每种EGFR基因突变位点上游和下游序列均能有效扩增。第二轮PCR结果显示，在第一轮扩增的产物中，上游序列和下游序列具有互补的末端，它们能以各自为模板进行第二轮有效扩增。连接、转换以及培养结果显示，每种EGFR突变型基因均能成功连接于质粒载体pMD19,并在大肠杆菌DH5a中克隆性增殖。PCR以及测序鉴定结果显示，EGFR突变基因能够有效的扩增，测序所得的碱基序列与EGFR常见突变序列一致。
结论：采用重叠延伸PCR法能够对EGFR基因实施定点突变，联合质粒连接和DH5α感受态细胞转导能够成功重建29种常见的EGFR基因突变体。
第二部分，ARMS荧光定量PCR检测体系建立
目的：建立一种由ARMS特异性引物技术和Taqman探针技术相结合的用于EGFR基因29种突变检测的实时PCR反应试剂盒。
方法：应用PrimerExpress3.0软件设计EGFR基因29种常见突变的ARMS特异性引物以及用于目的序列检测的Taqman水解探针，通过反复实验筛选并确定最终的ARMS引物和Taqman探针，并优化反应体系，建立试剂盒。然后，以第一部分所构建的基因突变体为研究对象，进一步分析该试剂盒的检测灵敏度、确立特异性和非特异性扩增的CutoffAΔCt值以及检测其最低分辨率，即敏感性。最后，在模拟血浆样本上，比较直接测序法和我们建立的TaqmanARMS法的敏感性。
结果：最终筛选和确定的ARMS引物和Taqman探针见表3。在无野生型基因以及背景DNA干扰的情况下，本试剂盒的检测灵敏度可达10copies。对于检测特异性方面，以正常人白细胞DNA为研究对象，浓度范围为1-50ng/ul，T790M和21L858R突变存在一定程度的非特异性扩增，但是其最小△CT（CT非特异-CT内参）仍分别高达11.36和14.89,而其他的突变G719X、19Del、20Ins、L861Q、S7681均未见非特异性扩增。在90份正常人血浆中提取的DNA(1-15ng/ul)进行特异性验证的研究显示，所有突变类型均未见非特异性扩增。对于检测分辨率方面，在500copies/ul野生型基因背景下，其最低检测分辨率达高达1%，即混有1%突变基因即可检出；在5000copies/ul野生型基因背景下，其最低检测分辨率高达0.1-0.5%，即混有0.1-0.5%突变基因即可检出。在对模拟血清样本进行检测发现，PCR测序敏感性在10%以上，而本试剂盒敏感性达0.5%，远高于测序法。
结论：本研究所设计的EGFR基因突变检测试剂盒具有较高的灵敏度、特异性和敏感性，而且价格便宜，操作时间短，值得临床进一步验证。
第三部分ARMS荧光定量PCR法检测NSCLC组织标本EGFR基因突变状况
目的：评价第二部分所设计的ARMS荧光定量PCR试剂盒(Taqman-ARMS)检测NSCLC组织EGFR基因突变的性能。
方法：采用TaqmanARMS方法一共检测组织标本100份。其中有29份标本，分别采用ScorpionsARMS法和我们的方法Taqman-ARMS进行EGFR基因突变检测，通过比较两种方法检测结果的差异，来评价这两种方法检测的一致性，同时对Taqman-ARMS法检测出存在突变的标本进行测序验证。另有29份临床标本，分别采用ME-PCR+基因测序法和我们的方法Taqman-ARMS进行EGFR基因突变检测，通过比较两种方法检测结果的差异，来评价这两种方法检测的一致性。
结果：100份临床标本，TaqmanARMS法检出19Del21例，21L858R18例，201ns1例，G719X1例，总突变率为41.0%(41/100)。从EGFR基因突变分布看，19Del占51.2%(21/41)，21L858R占43.g%(18/41)，20Ins占2.4%(1/41)，G719X占2.4%(1/41)．未检出T790M突变。
29例临床标本，ScorpionsARMS法检出19Del3例、21L858R6例，总突变率为31.0%;Taqman-ARMS法检出19Del3例、21L858R5例，总突变率为27.6%。对这8例标本进行测序验证，除1例测序失败外，其余7例测序结果与Taqman-ARMS检测结果完全一致。两种方法对19Del突变检出一致率为93.1%，Kappa值为0.627;对21L858R突变检出一致率为96.6%，Kappa值为0.890。
另29份临床标本，ME-PCR+测序法检出19Del8例、21L858R8例，总突变率为55.2%;Taqman-ARMS法检出J9Del9例、21L858R7例、20Ins1例、G719X1例，总突变率为62.1%。两种方法对19Del突变检出一致率为96.6%，Kappa值为0.918;对21L858R突变检出一致率为89.7%，Kappa值为0.732。
结论：我们所设计的TaqmanARMS荧光定量PCR试剂盒是一种快速、简便、经济以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法，值得在临床上进一步验证和推广。
蝎形探针;荧光探针;扩增阻滞突变系统;富集多聚酶链式反应;非小细胞肺癌;EGFR基因;基因突变检测;试剂盒开发
清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院
博士
呼吸内科
李龙芸
2011
中文
R734.2;R730.43
88
2012-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）