线粒体功能障碍在高糖刺激的小鼠足细胞凋亡中的作用机制研究
目的：观察高糖培养的小鼠肾脏足细胞中凋亡发生的情况，探讨传统线粒体凋亡途径在糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡发生中的可能作用，以便更深入的了解糖尿病(diabetes mellitus，DM)肾损伤的潜在分子机制。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病临床常见且有严重并发症之一，在其发展过程中，肾脏固有细胞过度凋亡导致的细胞增殖与凋亡关系的不平衡是肾功能恶化甚至衰竭的重要机制之一。肾小囊内层上皮细胞，即足细胞是高度特异、终末分化的上皮细胞，是肾小球滤过屏障的重要成分，在肾小球疾病的发生发展中发挥重要作用，从足细胞角度重新认识肾脏疾病逐渐成为研究热点。细胞凋亡是足细胞损伤表型改变的主要特征之一，与多种信号通路密切相关。细胞凋亡又称程序性死亡，广泛存在于细胞生物的各种组织中，死亡受体途径和线粒体损伤途径是两条经典凋亡途径，其中线粒体是细胞进行呼吸作用的细胞器，是细胞能量代谢的中心，具有通过氧化磷酸化合成ATP产生能量的重要功能，多种因素如：缺血、缺氧、氧化应激产物堆积等均可干扰线粒体功能，促进线粒体膜通透性增加，线粒体跨膜电位难以维持，细胞色素C(Cytochrome C，Cyt-c)释放，引发caspase级联反应，最终活化蛋白水解酶caspase-3，导致细胞凋亡。本实验模拟糖尿病的体外环境，观察体外培养的小鼠足细胞的凋亡情况，并通过检测线粒体膜电位以及相关凋亡因子caspase-3、Cyt-c的表达变化，探讨线粒体功能障碍在高糖刺激的小鼠足细胞凋亡中的作用。 方法：常规培养小鼠足细胞(mouse podocyte，PC)，将分化成熟的足细胞经无血清培养基同步化12h后分为分成2组：正常糖对照组(NG)：D-葡萄糖1g/L：高糖刺激组(HG)：D-葡萄糖4.5g/L，于刺激24、48、72h后收集细胞及蛋白，透射电镜观察细胞超微结构改变；TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡；流式细胞术检测线粒体跨膜电位；免疫细胞化学和Western blot检测足细胞中Caspase-3蛋白的表达变化；Western blot检测Cytochrome C蛋白的表达变化。 结果：⑴透射电镜结果显示，正常足细胞结构清晰，可见少许微绒毛、细小突起。高糖刺激下，足细胞绒毛及突起增多，细胞内可见大量空泡，线粒体形态无明显改变；⑵流式细胞术及TUNEL法结果均显示：高糖刺激组细胞凋亡数明显高于对照组；⑶高糖刺激组较正常对照组足细胞线粒体膜电位(mitochondrialtranmembrane pitentials，△ψm)明显下降；⑷免疫组化结果：对照组足细胞Caspase-3有少量阳性表达，高糖刺激后，细胞内Caspase-3蛋白表达明显增强；⑸Western blot结果：高糖刺激组Cytochrome C、Caspase-3表达较正常对照组增高。 结论：高糖刺激的足细胞线粒体膜电位明显下降，释放到胞质中的Cyt-c增高，Caspase-3表达上调，提示高糖刺激引起了足细胞中线粒体功能障碍，其相关凋亡途径可能参与了足细胞的凋亡过程，并在DN的发生和发展中起着关键作用。
糖尿病肾病;线粒体电位;蛋白水解酶;细胞病理学
河北医科大学
硕士
内科学
李素敏
2012
中文
R692.02;R361.3
38
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）