PCR检测大鼠卡氏肺孢子菌感染的研究
目的：肺孢子菌是一种机会致病性真菌，某些艾滋病、器官移植、恶性肿瘤等免疫功能低下的患者易被感染，严重者不及时治疗可导致死亡。因此，早期准确、及时的诊断肺孢子菌感染在临床治疗方面是十分关键的。目前诊断肺孢子菌感染最常用的方法是病原学检测，染色镜检的优点是可直接观察到病原体，特异性较好，但缺点是操作繁琐、敏感性较低，许多学者将研究方向转向免疫学和分子学诊断，来提高肺孢子菌感染的检出率。本研究应用地塞米松连续肌肉注射诱导Wistar大鼠感染肺孢子菌，建立肺孢子菌肺炎(PCP)动物模型，设计引物，建立PCR方法。采集PCP模型动物血液、肺、肾、肝、脾等组织及肺泡灌洗液分别进行PCR检测，并与Giemsa染色病原检测结果在特异性和敏感性方面进行比较，以期建立一种敏感性和特异性都较好的检测大鼠卡氏肺孢子菌的PCR方法，为临床检测人感染耶氏肺孢子菌提供检测手段。
方法：雌性Wistar大鼠50只，6周龄，体重180-210g。按文献报告方法建立大鼠肺孢子菌肺炎(PCP)模型。将50只Wistar大鼠随机分成3组：空白对照组10只，实验对照组10只，实验组30只.分笼饲养，每笼5只，常规饲养1周后，实验组大鼠腹股沟皮下注射地塞米松1mg/只/次，每周2次，连续12周，期间给予常规商品饲料，为防细菌感染，在大鼠饮水中加入四环素，浓度为1g/L；同时实验对照组大鼠腹股沟皮下注射等量的生理盐水，并给予常规饲料和饮水；空白对照组10只大鼠给予常规饲料和饮水，鼠笼及垫料定期更换、消毒。
于饲养第二周后将实验组、实验对照组和空白对照组大鼠分别取血，EDTA抗凝，离心，上清冻存(-80℃)，沉淀用蒸馏水洗2次，生理盐水洗1次，弃上清，冻存。然后以同样方法分别于第五周、第六周、第七周、第八周、第九周、第12周取血冻存。饲养12周后，乙醚麻醉大鼠，抽取肺泡灌洗液，并取肺组织、肝组织、肾组织、脾组织进行卡氏肺孢子菌的PCR检测，同时做各组织的印片，进行Giemsa染色，同时根据实验设计合成两对引物：第一对引物为根据5SrRNA基因设计的引物Ⅰ：5’－AGTTACGGCCATACCTCAGA－3’，引物Ⅱ：5’－AAAGCTACAGCACGTCGTAT-3’；第二对引物为根据线粒体rRNA大亚基基因(MT基因)设计引物Ⅰ：5’－GATGGCTGTTTCCAAGCCCA－3’，引物Ⅱ：5’－GTGTACGTTGCAAAGTACTC-3’。利用两对引物分别作PCR检测，将PCR检测结果与病原学检测结果进行比较分析。
结果：
1、一般状况
实验对照组和空白对照组大鼠一般状况良好，饮食及活动正常，毛色有光泽，均能健康存活，第12周处死时，肺脏未见病变。
实验组大鼠经地塞米松诱导后，从第三周开始部分大鼠活动及摄食明显减少，消瘦，体毛灰暗无光泽，精神萎靡，常成群挤在一个角落，并出现呼吸急促等症状，解剖可见肺脏萎缩，表面可见结节样米粒大小的病灶散在分布，部分融合成片状。
2、病原学检查(Giemsa染色)
肺组织印片病原学检查结果：空白对照组10只大鼠及实验对照组10只大鼠肺组织印片中均未查到卡氏肺孢子菌包囊，实验组25只大鼠肺组织印片中有18只查到卡氏肺孢子菌包囊，阳性率为72％(18/25)。
肝、肾、脾组织印片病原学检查结果：空白对照组10只大鼠、实验对照组10只大鼠及实验组25只大鼠肝、肾、脾组织印片中均未查到卡氏肺孢子菌包囊。
支气管肺泡灌洗液涂片病原学检查结果：空白对照组10只大鼠及实验对照组10只大鼠支气管肺泡灌洗液涂片中均未查到卡氏肺孢子菌包囊，实验组25只大鼠支气管肺泡灌洗液涂片中有15只查到卡氏肺孢子菌包囊，阳性率为60％(15/25)。
3、PCR检测结果
肺组织DNA的PCR检测结果：空白对照组10只大鼠及实验对照组10只大鼠肺组织DNA均未扩增出特异条带，为阴性，25只实验组大鼠有22只扩增出特异条带，为阳性，阳性率为88％(22/25)。第一对引物与第二对引物的扩增电泳结果一致。
支气管肺泡灌洗液(BALF)PCR检测结果：空白对照组10只大鼠及实验对照组10只大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)均未扩增出特异条带，为阴性；25只实验组大鼠支气管肺泡灌洗液利用第一对引物扩增有17只扩增出特异条带，为阳性，阳性率为68％(17/25)，利用第二对引物扩增有18只扩增出特异条带，为阳性，阳性率为72％(18/25)。
肝、肾、脾组织DNA的PCR检测结果：空白对照组10只大鼠、实验对照组10只大鼠及实验组25只大鼠肝、肾、脾组织DNA利用第一对引物及第二对引物均未扩增出特异条带，为阴性。
白细胞DNA的PCR检测结果：空白对照组10只大鼠、实验对照组10只大鼠及实验组25只大鼠白细胞DNA利用第一对引物及第二对引物均未扩增出特异条带，为阴性。
结论：
1.本实验成功建立了卡氏肺孢子菌动物模型，合成了两对引物(第一对引物为根据5SrRNA基因设计的引物Ⅰ：5’－AGTTACGGCCATACCTCAGA－3’，引物Ⅱ：5’－AAAGCTACAGCACGTCGTAT-3’；第二对引物为根据线粒体rRNA大亚基基因(MT基因)设计的引物Ⅰ：5’－GATGGCTGTTTCCAAGCCCA-3’，引物Ⅱ：5’－GTGTACGTTGCAAAGTACTC-3’并成功建立了卡氏肺孢子菌的PCR检测方法。
2.将PCR方法和病原学方法进行了比较，PCR检测大鼠肺组织及气管肺泡灌洗液中卡氏肺孢子菌的阳性率分别为88％和68％，病原学方法检测的阳性率分别为72％和60％，两者间有显著性差异(u检验，P<0.05)，PCR方法的敏感性远远高于Giemsa染色法。
3.利用第一对引物和第二对引物分别做PCR检测，结果阳性率无显著性差异(u检验，P>0.05)。
卡氏肺孢子菌;Giemsa染色;PCR检测;动物模型
河北医科大学
硕士
病原生物学
张时顺
2011
中文
R379
42
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）