赤芍总苷对人恶性黑色素瘤A375细胞的作用及其机制的研究
目的：赤芍是重要的活血化瘀中药，常用于肿瘤和血瘀证治疗。目前，仅有少数研究报道赤芍总苷(TPG)对肿瘤细胞的生长有抑制作用，但具体机理尚未阐明。本实验通过观察TPG对抑制人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、诱导细胞凋亡，研究其对细胞迁移、侵袭能力的影响，以及对细胞多药耐药性(MDR)逆转的作用机制，从分子生物学角度，为TPG抗肿瘤作用提供了理论基础。
方法：1、MTT法测定细胞抑制率黑色素瘤A375细胞以含10％胎牛血清的RPMI1640常规培养，取对数生长期的细胞制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔200μl，加入12.5、25、50、100、200mg/LTPG，对照组加等量生理盐水，每组6个复孔。分别孵育24、48h后进行MTT法，酶标仪测量各组细胞吸光度OD490值，计算生长抑制率(％)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。以上实验重复3次。
2、Westernblot分别检测PCNA、P21、P27及P53mRNA和蛋白的表达水平。
3、Transwell小室侵袭实验测定侵袭活性。RT-PCR和Westernbolt方法检测黑色素瘤细胞MMP－2、MMP－9和TIMP－2mRNA和蛋白的表达。
4、RT-PCR方法测定Caspase－3、Bcl－2、Bax、Fas、FasLmRNA的表达。黑色素瘤细胞细胞加入25mg/LTPG孵育48h，收集细胞，常规方法提取RNA，按RT-PCR试剂盒说明进行反转录反应和PCR扩增目的片段。Westernblot法检测Caspase－3、Bcl－2、Bax、Fas、FasL蛋白的表达。
5、逆转录－聚合酶链反应法(RT-PCR)检测细胞多药耐药基因1(MDR1)、生存素(Survivin)、拓扑异构酶Ⅱ同工酶(TOP2A)、多药耐药相关蛋白(MRP1)mRNA的表达情况；蛋白质印迹(Westernblot)法检测细胞MDR1、Survivin、TOP2A、MRP1蛋白表达水平。
结果：
1、TPG对黑色素瘤A375细胞抑制率的影响TPG对A375细胞有抑制作用，Westernblot结果显示，100mg/LTPG处理黑色素瘤细胞48h后，PCNA蛋白水平显著下降(P<0.01)，是对照组的47.0％，细胞周期抑制蛋的P21、P27以及P53蛋白水平显著上升，分别是对照组的2.5倍、2.03倍、2.31倍(P<0.01)。
2、TPG能显著抑制黑色素瘤A375细胞的迁移和侵袭，与对照组比较，TPG组细胞MMP－2、MMP－9mRNA和蛋白表达明显下降，TIMP－2mRNA和蛋白表达显著上升(P<0.01)。
3、TPG对黑色素瘤A375细胞Caspase－3、Bcl－2、Bax、Fas、FasLmRNA表达的影响与对照组比，TPG处理组Caspase－3、Bax、Fas、FasLmRNA表达水平均显著升高(P<0.01)，Bcl－2mRNA表达水平显著下降(P<0.01)，Bcl－2/Bax比值明显降低(P<0.01)，与mRNA表达变化一致。
4、TPG对黑色素瘤A375细胞MDR1、Survivin、TOP2A、MRP1mRNA及蛋白表达的影响与对照组比，TPG处理组MDR1、Survivin、TOP2A、MRP1mRNA及蛋白表达均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。
结论：
1、赤芍总苷能显著抑制黑色素瘤A375细胞的增殖，且呈浓度依赖性，当浓度达到200mg/L时抑制率可达到80％以上。
2、TPG可通过下调MMP－2、MMP－9、上调TIMP－2，调节MMP－TIMP平衡，而发挥抑制黑色素瘤A375细胞迁移和侵袭的作用。
3、赤芍总苷诱导黑色素瘤A375细胞凋亡，其机制可能是与上调Caspase－3、Bax、Fas、FasL基因蛋白、下调Bcl－2基因蛋白表达，PCNA蛋白水平下降和细胞周期抑制蛋白P21、P27以及P53蛋白水平显著上升有关。
4、赤芍总苷可能通过下调多药耐药因子MDR1、Survivin、TOP2A、MRP1mRNA及蛋白表达，逆转黑色素瘤的多药耐药，提高化疗敏感性、改善黑色素瘤的治疗效果。
赤芍总苷;人黑色素瘤A375细胞;细胞增殖;多药耐药性
河北医科大学
硕士
流行病与卫生统计学
周吉坤
2011
中文
R739.5;R730.52
38
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）