抑制p53缺失和突变型白血病细胞PPP2R5A表达后细胞生物学变化
目的:Nucleostemin是2002年发现并被命名的一种基因,其表达产物NS蛋白参与维持干细胞和肿瘤细胞的增殖状态,广泛表达于干细胞和肿瘤细胞的胞核中,可以通过与P53蛋白相结合影响细胞的生物学效应。人为下调NS的表达可以改变细胞的生物学性状。先前的研究证实NS在多种白血病细胞系以及急性白血病中都存在高表达现象,也通过一系列分析推测NS除了与细胞内的P53相结合外,还有可能存在另外一条信号转导通路发挥作用。有关资料显示NS与人蛋白磷酸酶2A(PP2A)上的调节亚基的α异构体PPP2R5A之间有着相互作用。PP2A是哺乳动物中含量最为丰富的丝/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶,约占细胞总蛋白的0.3％,被认为在许多生命活动中扮演了重要的角色,尤其是细胞的分化、增殖和凋亡,通过对蛋白激酶的反馈调节,在许多信号通路中起着重要的作用,在细胞膜、质和核中都行使着重要的功能,同时也参与了肿瘤的发生与发展。先前的课题研究证实PPP2R5A在急性白血病细胞中也存在表达并通过免疫组化和免疫共沉淀技术证实两者之间有着相互结合,此现象提示了PPP2R5A有可能是NS除P53外的另一条信号转导通路。这也解释了对于大部分急性白血病细胞都是p53缺失或者突变,不能产生有正常功能的P53蛋白的同时,NS是通过何种途径发挥其维持细胞增殖状态作用的。导师课题的总目标是探讨是否存在非P53依赖性的NS信号传导途径,如果存在,此通路是否与PPP2R5A介导的信号通路有关?本课题为其中一个小子课题,旨在验证PPP2R5A是否和细胞的增殖、分化、凋亡相关,人为抑制PPP2R5A的表达,细胞的生物学状态是否有所改变,为寻找非P53依赖性信号转导通路奠定基础。
方法:
(1)利用脂质体转染技术将针对PPP2R5A的siRNA转染到白血病细胞HL-60、THP-1和Raji细胞内,沉默PPP2R5A基因。
(2)RT-PCR法和免疫细胞化学法检测siRNA的转染效果并找出最佳转染浓度和时间。
(3)倒置显微镜观察转染组和对照组细胞的生长状态并绘制细胞生长曲线。
(4)瑞-吉染色观察转染组和对照组细胞的胞核、染色质及形态改变。
(5)流式细胞术Annexin V/PI双染法进行细胞凋亡分析,PIDNA染色法进行细胞周期测定。
(6)数据结果用SPSS17.0统计软件处理,对定量资料的统计学均数用均数圭标准差来表示,对于定性资料用卡方检验,多样本均数比较采用方差分析,如果方差不齐则进行变量变换。显著性检验水准为α=0.05。
结果:
(1)RT-PCR法和免疫细胞化学染色显示1×105/ml的细胞浓度,siRNA-PPP2R5A终浓度为65nM时转染后细胞PPP2R5A表达量显著降低。
(2)倒置显微镜观察显示转染48h后细胞出现大小不均,聚团性变差,细胞散在或不聚团,细胞形状不一,部分细胞胞体不完整,细胞碎片增多。
(3)瑞-吉染色显示转染后细胞形态变的不规则,胞体大小不一,胞体不完整,碎片增多,核趋于聚集,并有凋亡小体形成。
(4)细胞凋亡分析和细胞周期测定显示转染组凋亡细胞百分比率增高,G1期和G2/M期细胞百分比上升,而S期细胞百分比减低,表明细胞增殖减弱。
结论:
(1)本实验成功转染急性白血病细胞,显著干预了PPP2R5A基因的表达,细胞呈现出一系列趋于凋亡和细胞周期改变的迹象。
(2)验证了PPP2R5A和细胞的凋亡分化有一定关系,为验证NS非P53途径的信号通路是否与PPP2R5A有关奠定了基础。
核干细胞因子;白血病细胞;PPP2R5A表达;脂质体转染;细胞生物学;流式细胞术;免疫组化
郑州大学
硕士
临床检验诊断学
岳保红
2012
中文
R733.7;R730.21
64
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）