IL-17对小鼠心肌细胞中单核细胞趋化蛋白-1表达的影响
背景与目的：
心肌炎是以心肌细胞的变性、坏死及单个核细胞浸润为特征的一种炎症疾病。心肌炎可由多种病因引起,其中最常见的是病毒感染引起的病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)。近年来VMC的发病呈上升趋势,严重威胁人们的生命健康。VMC的发病机制目前还不完全清楚,通常认为在病毒感染初期,病毒可直接侵害心肌,但严重的慢性持久的心肌病变主要是由自身免疫介导的。
Th17是新近发现的CD4+T辅助细胞亚群,IL-17是Th17细胞分泌的前炎性细胞因子。IL-17可以通过诱导其他炎症因子的表达,介导炎症细胞到局部的浸润及组织损伤,在炎症性疾病尤其是自身免疫性疾病中发挥重要作用。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)是最早发现的CC类趋化因子家族的成员,MCP-1对单核细胞有很强趋化活性,有关其在炎症性疾病中的作用一直很受人们关注,有研究显示,MCP-1是诱发VMC心肌组织炎症细胞浸润的重要机制之一。IL-17可通过诱导多种细胞产生MCP-1来介导单个核细胞迁移,参与炎症反应,且Th17细胞及IL-17被证实与VMC的发生和发展密切相关,但对于IL-17是否可以通过诱导心肌细胞MCP-1的表达来介导炎症细胞向心肌组织的浸润而参与VMC的病程发展尚未见文献报道。
本研究首先检测心肌细胞是否存在IL-17受体(Interleukin-17 receptor,IL-17R)的表达,在确定心肌细胞为IL-17靶细胞的前提下,进而研究IL-17对原代培养的小鼠心肌细胞中MCP-1表达的影响,为揭示IL-17和MCP-1在VMC中的作用机制提供实验依据。
方法：
(1)差速贴壁法分离乳鼠心肌细胞进行原代培养。
(2)采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌细胞中IL-17RA mRNA的表达情况,对RT-PCR扩增产物电泳后进行灰度扫描,半定量分析心肌细胞中MCP-1 mRNA表达的变化。
(3)采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌细胞培养上清中MCP-1蛋白的表达情况。
(4)实验分组:实验设有IL-17处理组、IL-17+抗-IL-17单克隆抗体处理组、IL-17+同型IgG对照组和空白对照组4组;并且设有IL-17处理的量效组和时效组各6组;实验均重复3次。
(5)用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析,实验数据用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,检验水准a=0.05。
结果：
(1)成功实现乳鼠心肌细胞的原代培养,经形态和搏动观察,确定心肌细胞的纯度＞95％。
(2)利用IL-17RA的特异性引物进行PCR扩增,扩增产物经电泳后检测到目的条带,表明心肌细胞中有IL-17RA的基因表达。
(3)以终浓度50ng/mL IL-17处理心肌细胞8h,结果表明MCP-1 mRNA和蛋白的表达均升高,同空白对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);以终浓度50ng/mL的IL-17和lOμg/mL抗-IL-17单克隆抗体共同处理心肌细胞,结果发现MCP-1 mRNA和蛋白的表达同空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),而IL-17(50ng/mL)和同型IgG(10μg/mL)对照组MCP-1 mRNA和蛋白的表达均升高,同空白对照组和IL-17+抗-IL-17单克隆抗体处理组相比差异有统计学意义(P＜0.05),而与IL-17处理组相比差异无统计学意义(P＞0.05),说明抗-IL-17单克隆抗体可以完全抑制IL-17对心肌细胞MCP-1的诱导作用,IL-17上调心肌细胞MCP-1的表达具有特异性。
(4)以终浓度分别为1,5,10,50,100ng/mL的IL-17刺激心肌细胞24h,MCP-1 mRNA和蛋白的表达基本呈浓度依赖式升高,且各浓度组与不加刺激因子的对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);以终浓度为50ng/mL的IL-17分别刺激心肌细胞2,4,8,12,24h,发现心肌细胞MCP-1 mRNA的表达量在IL-17作用4h时达到高峰,随后开始下降,而心肌细胞培养上清中MCP-1蛋白的量呈时间依赖式升高,且各时间组与空白对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。
结论：
(1)心肌细胞可以表达IL-17RA,为IL-17潜在的靶细胞。
(2)IL-17可上调心肌细胞中MCP-1的表达。
(3)IL-17诱导心肌细胞MCP-1表达的作用与IL-17呈浓度时间依赖性。
(4)IL-17在VMC中的作用在一定程度上可能是通过诱导心肌细胞MCP-1的产生而间接介导炎症细胞向心肌组织的迁移来实现的。
白介素17;单核细胞趋化蛋白1;心肌细胞;病毒性心肌炎;自身免疫;动物模型
郑州大学
硕士
临床检验诊断学
沈燕
2012
中文
R542.21
55
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）