加味白头翁汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜损伤修复作用的机理研究
目的：
溃疡性结肠炎(UC)的病因和发病机制目前还不十分清楚。近年来,随着对溃疡性结肠炎研究的深入,人们对溃疡性结肠炎发病及治疗有了新的认识,认为不论是肠道的原发性病变,还是继发性损害,均会造成结肠粘膜结构和功能的损伤,肠粘膜损伤与溃疡性结肠炎发病密切相关。肠粘膜不仅是营养物质消化、吸收的重要场所,同时也是致病微生物和毒素侵入的主要门户。生理情况下,机体可通过肠粘膜屏障来有效地阻止致病微生物和毒素的侵入,以保证机体处于健康状态。当肠粘膜屏障损伤时,肠道中的微生物和毒素便可突破肠粘膜屏障,进入门静脉和淋巴系统引起细菌移位,甚至发展为溃疡性结肠炎。
为明确炎性细胞调控因子NF-κB、β-防御素-2、TFF3、EGF及TGF-β1在肠道自我保护和损伤后修复机制中的重要地位,本课题采用高脂高糖饮食加上TNBS灌肠法复制湿热型溃疡性结肠炎大鼠模型,在结肠粘膜损伤方面“寻本溯源”,把研究的重点放在炎性细胞调控因子NF-κ B及β-防御素-2上。在肠道修复作用方面,则重点探讨TFF3、EGF、TGF-β1在溃疡性结肠炎发生发展及粘膜修复过程中的变化及相关调节机制。通过观察加味白头翁汤对NF-κ B活化及β-防御素-2、TFF3、TGFβ1、EGF表达的影响,进而探讨加味白头翁汤对溃疡性结肠炎肠道损伤修复的作用机理。从而为加味白头翁汤应用于溃疡性结肠炎临床提供理论基础,同时对中医治则治法的现代化研究作有益探讨。
方法：
将40只SPF级健康SD大鼠,雌雄各半,随机分为正常对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、加味白头翁汤组,每组10只。采用三硝基苯磺酸(TNBS)局部灌肠加高脂高糖法建立UC大鼠模型,动物模型制作成功后,中药治疗组给予加味白头翁汤灌胃,西药对照组给予柳氮磺胺吡啶(SASP)灌胃,模型组及正常对照组给予等容积的生理盐水灌胃,每天1次,连用15d。治疗结束后将大鼠固定于鼠解剖台上,腹腔注射20％氨基甲酸乙酯麻醉,剖取整个结肠组织,先行肉眼仔细观察各组大鼠结肠粘膜的充血、水肿、伪膜、溃疡和糜烂数目及面积病理改变情况,然后再取少量结肠粘膜组织石蜡包埋,HE染色,光镜观察大鼠结肠组织病理形态学变化。剩余结肠粘膜标本运用蛋白免疫印迹(Westem blot),法检测NF-κB的蛋白表达水平,用:Real-time PCR方法测定β-防御素-2、TFF3的基因表达变化,免疫组化法观察TGFβ1、EGF蛋白表达的变化。
结果：
1、加味白头翁汤方组与模型组相比较:大鼠的一般情况明显好转,大鼠脓血便和粘液便消失,大便成形,活动灵活,食欲好转,大鼠体重明显增高。加味白头翁汤方可使结肠粘膜组织损伤和病理组织学评分降低,与模型组比较,差异显著(P＜0.01)。结肠粘膜组织的充血、水肿、伪膜、溃疡和糜烂数目及面积减少,肠壁损伤修复,炎性细胞浸润减少,溃疡附近肠粘膜可见不连续粘液层覆盖,而粘膜下层则可见胶原纤维增生。
2、与正常组比较,模型组大鼠NF-KB p65表达显著增高,差异显著(P＜0.01);给予加味白头翁汤治疗后,NF-KB p65表达明显下降,与模型组比较,差异显著(P＜0.01);中药治疗组与西药对照组比较无显著差异(P＞0.05)。
3、与正常组比较,模型组大鼠结肠粘膜β-防御素-2表达显著增高,差异显著(P＜0.01);给予加味白头翁汤治疗后,结肠粘膜β-防御素-2基因表达明显下降,与模型组比较,差异显著(P＜0.01),中药治疗组与西药对照组比较无显著差异(P＞0.05)。
4、与正常组比较,模型组大鼠结肠粘膜TFF3略有降低,但没有显著差异(P＞0.05);给予加味白头翁汤治疗后,结肠粘膜TFF3基因表达明显上升,与模型组比较,差异显著(P＜0.01);中药治疗组与西药对照组比较无显著差异(P＞0.05)。
5、与正常组比较,模型组TGFβ1的表达明显增高,两组比较差异显著(P＜0.01),给予加味白头翁汤治疗后,TGFβ1相对表达明显下降,与模型组比较,差异显著(P＜0.01),中药治疗组与西药对照组比较无显著差异(P＞0.05)。与正常组比较,模型组EGF的表达明显低于正常组,两组比较差异显著(P＜0.01);给予加味白头翁汤治疗后,EGF蛋白相对表达明显增高,与模型组比较,差异显著(P＜0.01),中药治疗组与西药对照组比较无显著差异(P＞0.05)。
结论：
1、加味白头翁汤方可抑制UC的炎性细胞浸润,使炎症减轻,同时还有促进结肠粘膜损伤修复,恢复结肠粘膜的分泌功能的作用。说明本课题UC模型复制成功。加味白头翁汤方可通过减轻结肠炎症,促进结肠粘膜修复,从而起到治疗UC的作用。
2、 NF-KB p65的表达与UC病情严重性和活动性之间有一定关系,提示UC结肠粘膜组织的NF-KB表达水平可反映结肠组织的损害程度,对于病情评估和治疗效果判断可能具有潜在指导意义。加味白头翁汤组对UC大鼠模型过度激活的NF-KB有抑制作用,这可能是加味白头翁汤组治疗UC大鼠的作用机理之一。
3、加味白头翁汤方的治疗作用可能在于通过下调β-防御素-2基因表达含量,进而减轻结肠粘膜的炎症反应,杀伤肠道病原微生物,起到粘膜修复的作用。β-防御素-2可能是加味白头翁汤治疗UC作用的关键的靶位。
4、加味白头翁汤方可通过增加结肠上皮细胞TFF3的分泌从而促进受损结肠粘膜组织的修复。
5、加味白头翁汤对UC大鼠模型结肠粘膜TGFβ1蛋白表达有下调作用,从而抑制炎症的发生发展;对UC大鼠EGF的蛋白表达则有上调作用,能够促进受损粘膜周围的完好上皮细胞向损伤粘膜表面迁移覆盖,加快损伤粘膜的修复。
加味白头翁汤;溃疡性结肠炎;结肠粘膜修复;β-防御素-2
湖北中医药大学
博士
中医临床基础
邱明义
2012
中文
R574.62;R259
97
2012-09-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）