谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的应用
目的:
原核表达和纯化谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶,研究谷氨酰内切酶的生物化学特性;以重组谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶为基础,建立糖化血红蛋白酶法检测方法并对其初步评价。
方法:
以PQE60GIu△Cmut5质粒转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导、Ni-NTA亲和层析等步骤获得重组谷氨酰内切酶;以偶氮酪蛋白为底物测定谷氨酰内切酶活性和米氏常数,分析底物浓度、温度、pH、金属离子和EDTA对酶活性的影响,并用SDS-PAGE电泳和质谱研究其对Hb的水解作用。
以烟曲霉菌总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出果糖氨基酸氧化酶基因,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)/FAOX,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达和Ni-NTA纯化,获得重组果糖氨基酸氧化酶:以糖基化六肽为底物检测重组果糖氨基酸氧化酶活性。
利用谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的特性,建立糖化血红蛋白酶法检测方法,测定其准确度和精密度,并将其对临床标本的检测结果与实验室己建立的HPLC法和日本爱科来HA-8160型全自动糖化血红蛋白仪检测结果作相关性分析。
结果:
谷氨酰内切酶可以在M15菌中高效表达,纯化后重组蛋白质纯度高,相对分子量为33 kDa,比活性为540.3 U/mg。重组谷氨酰内切酶对偶氮酪蛋白的Km值为0.26 mmol/L,最适反应温度为55℃,最适pH为8.0,Ca2-和Mg2+能激活酶活性,Fe2+、Zn2+、Mn2+和EDTA则对酶活性有抑制作用。SDS-PAGE电泳和质谱显示重组谷氨酰内切酶对血红蛋白有特异性水解作用。
用Trizol试剂提取烟曲霉菌培养后的菌体,获得了烟曲霉菌的总RNA。以cDNA为模板,通过PCR扩增出约1300 bp的果糖氨基酸氧化酶基因。将构建的重组质粒pET32a(+)/TAOX进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳可见约1300 bp的目的片段,测序结果显示所含目的基因序列正确。阳性重组质粒经诱导表达后,上清液纯化后进行SDS-PAGE电泳,结果显示重组果糖氨基酸氧化酶的相对分子量约65 kDa。以糖基化六肽为底物,检测其比活性为22 U/mg。
依据酶法检测糖化血红蛋白的原理和谷氨酰内切酶、果糖氨基酸氧化酶的特性,建立了糖化血红蛋白Alc双试剂测定方法。该法对临床高值、低值标本的CV值分别为1.05%和0.89%;对Bio-Rad公司质控品的实测值在可接受范围之内。与HPLC法进行比较,其回归方程为Y=0.9772X-0.3432(r=0.9845);与HA-8160型全自动糖化血红蛋白仪测定结果也有良好的相关性,回归方程为Y=0.9853X-0.5604((r=0.9932)。
结论:
谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶可以分别在大肠杆菌M15和Rosetta(DE3)中获得高效表达。纯化后的重组蛋白质具有较高的生物活性,并可以用于糖化血红蛋白Alc的测定。建立的糖化血红蛋白酶学测定法具有准确度高、精密度好等优点。
谷氨酰内切酶;果糖氨基酸氧化酶;原核表达;检测方法;糖化血红蛋白
江苏大学
硕士
临床检验诊断学
陈盛霞;姜旭淦
2012
中文
R446.11
65
2012-09-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）