一种新型芥菜基因工程难性不育系的创建
利用雄性不育系则是杂种优势育种最重要的途径之一,其中,基因工程雄性不育系的利用被作为最具前景的育种途径,成为当今世界范围内研究、开发和利用的热点。而雄性不育新种质的创建、保持以及育性恢复是基因工程雄性不育研究的的核心问题。就基因工程雄性不育的保持来说,目前有两个途径:一是通过组织培养的方式进行保存,该方式技术性强,在大规模种子生产中应用困难;途径之二是与对应的非转基因保持系杂交,但其杂交后代中将产生约50%的可育植株而无法得到纯系,制种时需要田间使用除草剂以及亲本种子浪费等问题。另外,对于以采收果实、种子为栽培目的的农作物来说,还需要解决基因工程雄性不育杂种一代的育性恢复问题。因此,研究和探索基因工程雄性不育系保持以及育性恢复的新方法和途径非常必要。
植物雄性不育基因工程研究中,来自于解淀粉芽孢杆菌的RNA酶基因Barnase是最为常用的雄性不育目的基因。目前,利用Barnase雄性不育基因已经成功在油菜、菊苣、玉米中获得了商业化应用的雄性不育系。而针对Barnase毒蛋白的结构及酶活性研究结果显示,该蛋白可以被拆分为不具毒性的N端和C端多肽。而SspDnaE内含肽是在Synechocystissp.PCC6803(集胞藻,蓝藻的一种)中发现的一个具有反式剪接功能的断裂型内含肽,分别由123个氨基酸的N端肽链和36个氨基酸的C端肽链组成,其结构及剪接特点非常适合用于分拆后蛋白质N端和C端肽链之间的连接,并恢复蛋白的结构和功能。因此,本论文结合植物核雄性不育的特点,以芥菜为研究对象,将Barnase基因序列分拆成为36个氨基酸的N端和75个氨基酸的C端部分,并分别与SspDnaE内含肽N端和C端融合获得融合基因并置于绒毡层特异启动子A9的调控下,融合基因分别导入芥菜时获得可育转基因植株。而将两个融合基因共转化或者获得的单独转化植株进行杂交,获得的共转化植株或者杂交后代植株因两条融合多肽在绒毡层细胞中共表达,通过SspDnaE内含肽所具有的反式剪接功能,Barnase毒蛋白的结构和功能在绒毡层细胞中恢复,获得了雄性不育。该雄性不育系与其它非转基因植株杂交后,获得的杂交后代将因N端和C端融合基因分离而育性得到恢复。获得的主要研究结果如下:
1、构建了系列表达载体用于芥菜的单独转化或共转化,获得芥菜转基因植株
(1)pCABarBN:大白菜绒毡层特异启动子A9驱动非拆分Barnase毒蛋白基因表达,筛选标记基因为Bar基因;(2)pCABarBN-N/Int-N:A9启动子驱动Barnase毒蛋白基因N端(1-36位氨基酸)与SspDnaEN端(123个氨基酸)融合基因表达,筛选标记基因为Bar基因;(3)pCANPTInt-C/BN-C:A9启动子驱动SspDnaEC端(36个氨基酸)与Barnase毒蛋白C端(37-111位氨基酸)融合基因表达,筛选标记基因为NPTⅡ基因;(4)pCABarBN-N:A9启动子驱动Barnase毒蛋白基因N端(1-36位氨基酸)多肽表达,筛选标记基因为Bar基因;(5)pCANPTBN-C:A9启动子驱动Barnase毒蛋白基因C端(37-111位氨基酸)多肽表达,筛选标记基因为NPTII基因。通过农杆菌介导法,将pCABarBN、pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C分别单转化于芥菜;分别将pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N与pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTBN-C共转化于芥菜,获得转基因芥菜植株。经含草丁膦PPT的筛选培养基多次筛选,分别获得了pCABarBN、pCABarBN-N/Int-N、pCABarBN-N转基因植株;经含卡那霉素的筛选培养基多次筛选,分别获得了pCANPTInt-C/BN-C、pCANPTBN-C转基因植株;经含草丁膦和卡那霉素筛选培养基的多次筛选,分别获得了pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N与pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTBN-C基因共转化植株。
2、转基因芥菜植株的分子检测
利用CTAB法提取各转基因植株幼苗DNA,进行目的基因的PCR鉴定,结果显示所有单转化植株中,相应的目的基因已整合到芥菜植株中。而获得的pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N与pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTBN-C共转化植株均同时整合入了N端和C端基因。
3、转基因芥菜植株的育性比较
获得的转基因芥菜植株开花后,对其雄性不育性进行了比较分析。结果显示上述pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C单独转化植株以及pCABarBN-N与pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTBN-C基因共转化植株均表现为雄性可育,其花瓣鲜黄色、花丝较长、花药饱满,花药成熟开裂后有大量花粉散出;而pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C基因共转化植株与pCABarBN转基因植株一样,出现了典型的雄性不育性状,花瓣淡黄色、花丝较短、花药瘦小,花粉囊里没有花粉出现。
4、转基因芥菜植株花粉细胞发育分析
利用石蜡切片和显微观察技术对上述获得的转基因芥菜可育植株和不育植株的花药发育过程进行了分析。结果显示,可育植株(转pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C以及pCABarBN-N与pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTBN-C基因共转化植株)的花药发育正常,可发育为成熟的花粉粒:而pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C的共转化植株与pCABarBN植株的花粉发育过程基本一致,花粉绒毡层细胞提前降解,花药发育成熟后无正常花粉粒产生,花药败育。
5、转基因芥菜植株的结子习性
将上述获得的转基因植株分别进行自交,结果显示pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C单转化植株以及pCABarBN-N与pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTBN-C共转化植株自交后大多数果荚饱满,有正常形态种子形成。而转pCABarBN基因植株自交后花朵早期脱落,不能结荚,无种子形成;pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C共转化植株能够结荚,但与可育株相比,果荚短小、空瘪,无种子形成。而pCABarBN转基因植株、pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C共转化植株用来自非转基因植株的花粉授粉后,则均能正常结荚结籽。
6、pCABarBN-N/Int-N和pCANPTInt-C/BN-C转基因植株杂交后代育性分析
将获得的T0代pCABarBN-N/Int-N转基因植株与pCANPTInt-C/BN-转基因植株进行杂交,获得的杂交后代进行卡那霉素与草丁膦抗性筛选,再经PCR检测确定同时含pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C基因的双抗性植株,双抗植株开花后的育性调查结果显示,与pCABarBN-N/Int-N与pCANPTInt-C/BN-C基因共转化植株一样,这些杂交后代植株也表现出典型的雄性不育性状。
芥菜;基因分拆;DnaE内含肽;雄性不育系;Barnase基因
西南大学
硕士
蔬菜学
宋洪元
2012
中文
S637
55
2012-09-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）