miR-17-5p/20a在胃癌诊断中的应用及其作用机制研究
目的：miR-17-5p和miR-20a(miR-17-5p/20a)在多种肿瘤中表达失调，但是其在胃癌组织中的表达情况、临床意义、作用机制以及在胃癌诊断、疗效监测及预后判断方面的应用尚不清楚。本研究旨在揭晓胃癌组织中miR-17-5p/20a表达的临床意义，揭示miR-17-5p/20a在胃癌发展中的功能，阐明miR-17-5p/20a对胃癌细胞作用的分子机制，明确循环miR-17-5p/20a在胃癌诊断与治疗中的用价值。
方法：采用定量RT-PCR检测157例胃癌组织和相应癌旁组织中miR-17-5p/20a的表达，结合临床病理资料分析其临床表达意义。以胃黏膜上皮细胞株GES-1为对照，比较胃癌细胞株(HGC-27，BGC-823，SGC-7901和AGS)中miR-17-5p/20a的表达水平。选择低表达miR-17-5p/20a的胃癌细胞转染miRNA mimics使之过表达，选择高表达的胃癌细胞转染miRNA inhibitors抑制其表达，通过细胞计数、平板克隆、流式分析细胞周期、TUNEL检测细胞凋亡及Western blot检测增殖凋亡相关蛋白，分析miR-17-5p/20a在胃癌细胞中的功能。体内建立BALB/c裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，采用antagomir-17-5p和antagomir-20a瘤内定点注射治疗，测量瘤体大小并绘制瘤体生长曲线，通过定量RT-PCR检测瘤组织内miR-17-5p/20a的表达、病理切片TUNEL检测细胞凋亡及Western blot检测增殖凋亡相关蛋白观察体内靶向抑制miR-17-5p/20a对胃癌治疗的效应。采用TargetScan和PicTar生物信息软件预测、野生型和突变型靶基因3‘UTR荧光素酶报告基因构建与检测、定量RT-PCR和Western blot验证检测明确miR-17-5p/20a调控的靶基因。Western blot检测分析胃癌组织和癌旁组织中靶基因蛋白与miR-17-5p/20a表达水平的相关性，MDM2干扰片段或表达载体与miRNA mimics共转染阐明miR-17-5p/20a在胃癌发展中的调控分子机制。收集65例胃癌患者术前、16例术后和6例复发患者血浆标本，14例配对的胃癌术前和术后血浆标本，90例健康志愿者血浆标本作对照。采用定量RT-PCR比较循环miR-17-5p/20a表达量，结合术前患者病理资料分析其临床意义以及与病程相关性。随访并记录术前患者生存率，采用Kaplan-Meier、logrank test、单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析循环miR-17-5p/20a在胃癌预后预测中的价值。定量RT-PCR检测antagomir-17-5p/20a治疗前后BALB/c裸鼠血清中循环miR-17-5p/20a表达的改变，评估循环miR-17-5p/20a在疗效监测中的应用。
结果：建立了miR-17-5p/20a定量RT-PCR检测方法，胃癌组织中miR-17-5p/20a的表达仅与胃癌体积大小相关。miR-17-5p/20a在胃癌细胞AGS中表达水平最低，而在SGC-7901中表达最高。选择AGS和SGC-7901分别进行过表达和低表达试验研究。miR-17-5p/20a过表达可增加胃癌细胞数量，促进细胞提前进入S期，减少凋亡细胞数并上调CDK2、磷酸化ERK(p-ERK)和BCL2的表达，抑制Caspase3的活化。miR-17-5p/20a低表达抑制细胞平板克隆形成，诱导细胞周期阻滞于G1/G0期，增加凋亡细胞数量并伴有CDK2、p-ERK和BCL2的表达下调，活化了Caspase3。与PBS和antagomir阴性片段对照组相比，体内antagomir-17-5p/20a治疗组肿瘤体积小且生长速度受到抑制，瘤组织内miR-17-5p/20a的表达显著降低，并伴有CDK2、p-ERK和BCL2表达的下调及Caspase3活化。生物信息学软件预测结合实验研究验证并确定miR-17-5p/20a通过与mRNA3’UTR位点结合在转录后水平靶向负调控p21和TP53INP1。胃癌组织中miR-17-5p/20a与其靶基因TP53INP1的蛋白表达成负相关，而与p21蛋白表达水平不成负相关。但这些组织中MDM2与p21蛋白表达水平却始终成负相关性。MDM2的表达可随着miR-17-5p/20a表达升高而增加，同时又可随着miR-17-5p/20a表达降低而减少。MDM2的低表达可以逆转miR-17-5p/20a对p21的抑制作用及消除其过表达后促进细胞提前进入S期，减少凋亡细胞的数量并上调CDK2、p-ERK和BCL2的表达，抑制Caspase3的活化的作用。MDM2的表达恢复又可以一定程度上恢复miR-17-5p/20a过表达后对p21的抑制作用和促进胃癌细胞增殖的功能，援救MDM2低表达对其带来的损害。术前循环miR-17-5p/20a表达水平与胃癌细胞的分化程度和TNM分期密切相关。与术前表达水平比较，术后循环miR-17-5p/20a表达明显降低，而复发患者中的表达量增加并接近术前表达水平。Kaplan-Meier、logrank test和单因素Cox比例风险回归分析显示高表达循环miR-17-5p/20a的患者预后差。多因素Cox比例风险回归模型分析发现循环miR-20a可作为独立的危险预测因子进行预后判断。体内裸鼠治疗模型结果显示antagomirs治疗组血清中miR-17-5p/20a的表达逐渐下调。
结论：miR-17-5p/20a通过转录后水平抑制p21和TP53INP1的表达，加速胃癌细胞周期进程和抑制细胞凋亡来促胃癌细胞增殖。MDM2是miR-17-5p/20a负向调控p21和功能发挥的重要介导因子，协助miRNAs发挥致癌作用。循环miR-17-5p/20a可以用于指示胃癌临床病理进程，反映治疗疗效及进行预后判断。本研究工作为miR-17-5p/20a在胃癌中以癌基因发挥作用提供新的分子调控证据，为胃癌的治疗提供有效的靶点，为胃癌的诊断提供新的非创伤性分子指标。
miR-17-5p蛋白;miR-20a蛋白;突变型靶基因;胃癌;早期诊断;循环microRNA;预后判断
江苏大学
博士
临床检验诊断学
许文荣
2012
中文
R730.43;R735.2
120
2012-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）