骨髓间质干细胞对血吸虫性肝纤维化修复作用的研究
目的：观察骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)单独使用或MSCs与吡喹酮(praziquantel，PZQ)联合应用对血吸虫性肝纤维化的修复作用。通过体内外实验探讨MSCs对血吸虫性肝纤维化的作用机制，为MSCs治疗慢性血吸虫性肝损伤提供实验依据。
方法：①应用日本血吸虫尾蚴多次感染的方式建立血吸虫性肝纤维化的小鼠模型，并将小鼠分为5组：未感染对照组、PBS组、MSCs组、PZQ+PBS组、PZQ+MSCs组。在感染第9、10周，MSCs处理组每只小鼠分别给予5×105MSCs经尾静脉移植入肝损伤小鼠，PZQ处理组于感染第9周经灌胃给予300 mg/kg吡喹酮。②首次移植MSCs的第2、4周后分别应用ELISA和化学发光法检测血清中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和透明质酸(hyaluronic acid，HA)含量；病理切片苏木精-伊红染色法(HE)染色观察肝脏的组织学变化；Masson's三色染色观察肝脏胶原沉积情况；荧光定量RT-PCR检测肝组织胶原蛋白Ⅲ在转录水平的表达；免疫组织化学和Western blotting测定肝脏Vimentin，E-cadherin和α-SMA等在蛋白水平的表达；小鼠生存期和生存状态观察，来评价MSCs对血吸虫性慢性肝纤维化的修复作用。③分离、纯化血吸虫卵并提取SEA，培养巨噬细胞并将其分成5组：阴性对照组、SEA组、SEA+MSCs上清组(MSCs组)、SEA+NRK-52E上清组(NRK-52E组)、SEA+DMEM组(DMEM组)。除阴性对照组巨噬细胞不做任何处理外，其他各组给予20μg/ml SEA诱导巨噬细胞活化12小时后，MSCs组、NRK-52E组和DMEM组撤SEA，分别给予MSCs培养48小时上清、NRK-52E培养48小时上清和DMEM培养液，继续培养。④显微镜观察细胞上清培养12小时后各组细胞的形态；实时荧光定量RT-PCR检测细胞上清培养12小时和24小时后巨噬细胞TNF-α的mRNA水平；Western blotting检测细胞上清培养12小时后TGF-β1的蛋白表达水平；MTT法测定细胞上清培养24小时和48小时后巨噬细胞增殖情况。
结果：MSCs能显著提高小鼠生存率，移植8周后，MSCs组小鼠生存率为62.5％，而PBS组仅为12.5％(p＜0.05)；移植第2周和第4周后，MSCs组小鼠脾脏指数分别为0.017±0.002和0.024±0.005，均显著低于PBS组的0.026±0.006和0.033±0.004(p＜0.01)，在移植2、4周后，PZQ+MSCs组小鼠脾脏指数亦均显著低于PZQ+PBS组；在移植第2周和第4周，MSCs组小鼠血清HA含量分别为319.43±21.36μg/ml和186.00±30.14μg/ml，均显著低于PBS组的388.25±45.68μg/ml和333.44±43.58μg/ml(p<0.05)；在移植第2周和第4周，MSCs组小鼠血清TGF-β1水平分别为50.6±13.8 ng/ml和46.9+20.3 ng/ml，均显著低于PBS组的87.24-24.4 ng/ml和115.2±36.2 ng/ml(p＜0.05)；MSCs移植4周后，肝脏的组织学结构得到明显改善，且以PZQ+MSCs组改善更为显著，表现为炎症细胞浸润及胶原沉积均显著减少，虫卵结节的平均直径降低；移植4周后实时定量PCR检测到MSCs组Ⅲ型胶原mRNA的相对表达水平为阴性对照的1.82±0.84倍，低于PBS组的3.56±1.07倍(p＜0.05)，PZQ+MSCs组Ⅲ型胶原mRNA的相对表达为阴性对照的的1.06±0.34倍，远低于PZQ+PBS组的2.51±0.84(p＜0.01)；移植4周后，免疫组化结果显示MSCs组，尤其是PZQ+MSCs组小鼠肝脏Vimentin阳性细胞数减少而E-cadherin阳性细胞数显著增多。Western blotting结果也提示，与PBS组比较，MSCs组小鼠肝脏Vimentin和α-SMA蛋白表达水平降低(p＜0.05)，PZQ+MSCs组α-SMA亦显著低于PZQ+PBS组。体内实验结果提示MSCs能缓解血吸虫性肝纤维化，与PZQ联合应用修复效果更好。
与NRK-52E上清和DMEM培养液比较，MSCs上清培养巨噬细胞12小时后，细胞变圆，体积明显较小，伪足较少。细胞培养上清作用12和24小时后，MSCs组TNF-α的mRNA水平为阴性对照组的1.0±0.4倍和1.0±0.5，显著低于NRE-52E组的10.4±3.9倍(p＜0.05)和16.5±5.0倍(p＜0.01)，亦低于DMEM组的6.0±2.1倍和2.4±0.7倍(均p＜0.05)。细胞培养上清作用12小时后，Westernblotting结果显示MSCs组TGF-β1的表达显著低于SEA组、NRK-52E组和DMEM组。MSCs上清作用48小时后，MTT测吸光度为0.22±0.05，显著低于NRK-52E组的0.53±0.02和DMEM组的0.31±0.03(均p＜0.05)。体外结果表明，MSCs培养上清能抑制SEA诱导的巨噬细胞活化和增殖。
结论：MSCs能显著提高血吸虫性肝纤维化小鼠的生存率，有效缓解血吸虫性肝纤维化，与驱虫药吡喹酮联合应用能取得更好的治疗效果。其机制可能是通过诱导肝细胞间质-上皮转化和抑制巨噬细胞活化来修复肝损伤。结果提示，MSCs移植，尤其是和吡喹酮联合应用可以作为改善血吸虫性肝纤维化的有效措施。
血吸虫;可溶性虫卵抗原;肝纤维化;骨髓间质干细胞;巨噬细胞;吡喹酮
江苏大学
博士
临床检验诊断学
许文荣
2012
中文
R532.210.6;R457.7
103
2012-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）