应用高分辨熔解曲线系统检测髓系肿瘤中基因突变及其临床意义
目的：
(1)应用高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术建立髓系肿瘤中相关基因(C-KIT、IDH1、IDH2、DNMT3A、U2AF1和JAK2)突变的分子诊断平台。
(2)探讨这些基因突变的临床意义。
方法：
(1)临床病例收集、细胞分离及DNA提取：收集按FAB和WHO标准诊断的初诊急性髓系白血病(AML)221例、骨髓增生异常综合征(MDS)88例和骨髓增殖性肿瘤(MPN)142例骨髓标本，用人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)分离骨髓单个核细胞，DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。
(2)PCR扩增：针对不同基因(包括C-KIT、IDH1、IDH2、DNMT3A、U2AF1和JAK2)的基因突变位点建立相应的PCR扩增反应体系，在ABI7300 PCR扩增仪上分别对这些基因进行扩增。
(3)HRMA检测：将PCR扩增产物在LightScanner分析仪上进行荧光扫描，应用分析软件进行处理，分析HRMA检测不同基因突变的灵敏度，并进一步检测待测标本的基因突变情况。
(4)DNA测序：首先评估DNA测序检测不同基因突变的灵敏度，然后对HRMA扫描鉴定为突变的标本进行测序。
(5)突变的临床意义分析：用Spearman秩和相关检验进行突变与性别、年龄、血液学参数、染色体分组、FAB分型、WHO分型等的相关性分析；应用卡方检验或Fisher确切检验对突变阳性组和阴性组之间的分类变量(如性别、染色体分组、FAB分型和WHO分型等)进行差异性比较，应用Mann-Whitney U验对突变阳性组和阴性组之间的连续变量(如年龄和血液学参数等)进行差异性比较。应用Kaplan-Meier和Cox分析分别对生存时间进行单因素和多因素分析。
结果：
(1)C-KIT突变：①HRMA检测C-KIT突变的灵敏度达5％，高于DNA测序的灵敏度(10％)；②对160例AML患者进行检测发现9例(6％)存在C-KIT基因突变，进一步测序证实4例为D816V突变、4例为N822K突变、1例为D816H和N822K双位点突变；9例C-KIT突变主要发生于FAB-M2亚型，其中7例患者伴有t(8；21)易位，2例患者为正常核型。在25例t(8；21)易位AML患者中，C-KIT突变发生率为28％，突变者与非突变者比较，两组在性别、年龄、血象方面并无差异。
(2)IDHI/IDH2突变：①HRMA检测IDH1 R132H、IDH2 R140Q和IDH2 R172K突变的灵敏度分别为5％、2％和5％，均高于DNA测序的灵敏度(10％)：②对198例AML患者的进一步检测发现IDH1和IDH2突变发生率分别为2.0％(4例)和5.0％(10例)，均为杂合性突变、且均为单独发生。IDH1突变包括3例R132H和1例R132S突变，IDH2突变包括7例R140Q和3例R172K突变。伴IDH1/IDH2突变的AML患者年龄明显高于无突变者(P=0.002)。两组患者在性别、血细胞计数和FAB分型方面并无统计学差异(P＞0.05)。染色体核型正常的AML患者中IDH1/IDH2突变率(12/85，14.1％)明显高于核型异常患者(2/99，2.0％)(P=0.004)。③82例MDS患者分别检出2例(2.4％)和3例(3.6％)存在IDH1(R132H和R132S各1例)和IDH2突变(均为R140Q)。IDH1和IDH2突变均为杂合性、且均为单独发生。伴或不伴IDH1/IDH2突变者在性别、年龄、血红蛋白含量和血小板计数方面并无显著性差异(P>0.05)，但伴突变者的白细胞计数明显高于无突变者(P=0.010)。虽然全部突变均见于核型良好组，但并无统计学意义(P=0.407)。正常核型患者IDH1/IDH2突变率(5/52，9.6％)高于异常核型患者(0/30，0％)(P=0.153)。此外，根据IPSS分组，所有IDH突变均发生于低危组或中危-1组患者。多变量Cox分析揭示年龄和IPSS分组是MDS患者独立的预后因素，而IDH1/IDH2突变对生存时间并无影响。④85例慢性髓系白血病(CML)和57例Ph-MPN患者中均未检测出IDH1/IDH2突变。
(3)DNMT3A突变：①HRMA检测DNMT3A R882H突变的灵敏度为2％，高于DNA测序的灵敏度(10％)；②182例AML患者中12例(6.6％)检出DNMT3A突变，均为杂合性突变，包括8例R882H、3例R882C和1例R882P。R882突变与患者的性别和白细胞计数并无相关性，突变者年龄高于无突变者、且突变者血小板计数明显高于无突变者。DNMT3A R882突变更常见于单核类AML(M4和M5，7/52例，13.4％)而非单核类AML(M1、M2、M3和M6，5/130，3.8％)(P=0.041)。76例正常核型患者中10例(13.2％)存在R882突变，显著高于核型异常患者(2/92例，2.2％)(P=0.007)。③51例MDS患者检出4例(7.8％)DNMT3A R882突变，均为杂合性，包括3例R882H和1例R882C：伴或不伴DNMT3A突变者在年龄、血细胞计数、WHO分型等方面并无显著性差异；4例突变均发生于正常核型患者及IPSS中危组。伴突变者中位生存时间为9个月，而不伴突变者中位生存时间为25个月(P=0.047)。④79例CML和57例Ph-MPN患者中均未检测出DNMT3A突变。
(4)U2AF1突变：①HRMA检U2AF1 S34和Q157突变的灵敏度均为5％，高于DNA测序的灵敏度(10％)；②221例AML患者中4例(1.8％)检出U2AF1突变，均为杂合性突变，包括2例S34Y和2例Q157(1例Q157P和1例Q157R)突变。突变患者与非突变患者在性别、年龄、血细胞、FAB分型和核型分组之间并无差异。伴U2AF1突变的患者生存时间明显短于无突变者(中位时间分别为1和7个月，P=0.034)③88例MDS患者检出4例(4.5％)S34突变，均为杂合性，包括3例S34F和1例S34Y。伴或不伴U2AF1突变者在性别、血细胞计数、WHO分型和IPSS分组方面并无显著性差异。伴U2AF1突变者年龄较无突变者年轻(P=0.059)。72例患者具有随访结果，突变患者和无突变患者在生存时间上并无显著性差异(P=0.954)。④79例CML和57例Ph-MPN患者中均未检测出U2AF1突变。
(5)JAK2突变：①HRMA检测JAK2 V617F突变的灵敏度为5％，高于DNA测序的灵敏度(10％)；②48例Ph-的MPN患者中，JAK2 V617F突变可见于3例(100％，均为杂合子突变)真性红细胞增多症(PV)、34例(60％，6例纯合子突变、28例杂合子突变)原发性血小板增多症(ET)和3例(60％，1例纯合子突变、2例杂合子突变)原发性骨髓纤维化(PMF)。而57例CML患者均为阴性。HRMA的检测结果均经直接测序证实。诊断的特异性和灵敏度均为100％。
结论：
(1)HRMA是检测基因突变的一个高通量技术，其特异性好、灵敏度高、成本低廉，可有效用于对大批量标本进行基因突变的筛选。
(2)中国人群AML和MDS患者中存在IDH1和IDH2基因突变，均为杂合子突变，主要见于正常核型患者；IDH1/IDH2突变并非是MDS患者的不良预后因素。
(3)DNMT3A R882突变是中国人群AML和MDS患者的一个常见分子事件，该突变均为杂合子突变，主要发生于正常核型患者；DNMT3AR882突变是MDS患者的一个不良预后因素。
(4)中国人群AML和MDS中U2AF1突变发生于密码子S34和Q157，均为杂合子突变，但发生率相对较低；伴U2AF1突变的AML患者生存时间较短。
髓系肿瘤;高分辨熔解曲线;C-KIT基因;基因突变;临床诊断
江苏大学
博士
临床检验诊断学
许文荣
2012
中文
R733.3;R730.43
99
2012-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）