雷公藤甲素通过miR-21调节白血病细胞药物敏感性的分子机制
耐药是临床治愈白血病的一个主要障碍。肿瘤耐药是一种多因子共同作用导致的现象，尽管发现药物灭活，药物外排，存活通路激活，凋亡机制缺陷等与耐药有关，但是耐药的决定性因素尚不清楚。近来，大量的研究发现microRNA在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。其中，部分microRNA通过影响特定的信号通路影响肿瘤对化疗药物的敏感性。因此，microRNA在耐药形成中的作用日益受到学者们的关注。
MiR-21是第一个在人类基因组中发现的microRNA，并且是唯一在所有恶性肿瘤均高表达的microRNA。MiR-21被发现与肿瘤的诊断标志和预后标志显著相关，因此其可能成为恶性肿瘤诊断和预后判断的生物学标记。此外，异常表达的miR-21可以预测肿瘤对传统化疗药物，如吉西他滨，多西他赛，替莫唑胺，5-氟尿嘧啶等的反应。最近，几项研究探讨了miR-21在髓细胞白血病和淋巴细胞白血病耐药中的作用。研究发现，miR-21反义寡核苷酸提高三氧化二砷对急性髓细胞白血病细胞的毒性。抑制miR-21，增强三氧化二砷和阿糖胞苷诱导的慢性髓细胞白血病细胞的凋亡。MiR-21的这些作用，部分是通过影响PDCD4表达行成的。
雷公藤甲素是1972年首次从雷公藤根部提取的二萜类化合物，现在已经开发了人工合成的工艺。文献报道，雷公藤甲素具有抗炎，免疫抑制，抗生育和抗肿瘤作用。大量研究发现，雷公藤甲素在体外能够抑制多种肿瘤的增殖，诱导肿瘤的凋亡；在体内，雷公藤甲素可以抑制肿瘤生长和转移。研究证实，雷公藤甲素可以抑制细胞周期和细胞存活相关蛋白，包括cyclins D1，B1，and A1，Cdc-25；Bcl-X和c-Jun。雷公藤甲素还降低抗凋亡蛋白如XIAP，Bcl-2和Mcl-1等的表达。在白血病和卵巢癌细胞中，雷公藤甲素诱导caspase依赖的凋亡；在胰腺癌中，雷公藤甲素诱导caspase非依赖的自噬性死亡。
目的：本研究的目的是观察雷公藤甲素是否通过miR-21影响白血病细胞对化疗药物阿霉素的敏感性，并且探讨其可能的分子机制。
方法：
1.雷公藤甲素的毒性和耐药逆转作用采用MTT实验。
2.miR-21的表达采用SYBR green PCR方法。
3.NF-кB的活性采用EMSA方法检测。NF-кB与miR-21基因启动子区域结合采用ChIP方法。
4.miR-21模拟物和抑制物由化学合成，并且转染入K562细胞或K562/A02细胞。
5.P65，T-AKT，P-AKT，PTEN，BCL-2蛋白水平采用western blot检测。
6.细胞凋亡率采用流式细胞仪检测Annexin V/PI染色细胞。
7.流式细胞仪检测P糖蛋白表达。P糖蛋白功能检测采用罗丹明-123蓄积实验。
8.本研究假设，在K562细胞中，PTEN是miR-21的一个直接靶基因。为验证此假说，K562细胞共转染PTEN-3'非编码序列荧光素酶报告基因和miR-21。
9.为了探讨PTEN与阿霉素毒性的关系，PTEN siRNA被转染入K562细胞，接着采用一系列浓度的阿霉素作用。
10.P65，PTEN mRNA水平采用SYBR green PCR.方法检测。
结果：
1.因为耐药逆转剂需要采用对受试细胞无抑制或无毒性的浓度，雷公藤毒性试验结果提示，5 nmol/L雷公藤甲素被用于后续耐药逆转试验。
2.雷公藤甲素降低miR-21在K562/A02细胞的表达水平。P65 mRNA水平和蛋白水平，以及P65转录活性，在雷公藤甲素作用后明显下降。
3.ChIP试验和EMSA试验均证明NF-кB能够与miR-21启动子区域结合。ChIP试验进一步证明，K562/A02细胞经雷公藤甲素作用后，NF-кB与miR-21启动子结合明显下降。
4.5 nmol/L雷公藤甲素提高K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。3μg/mL阿霉素诱导的K562/A02细胞凋亡率为4.3％，当与5 nmol/L雷公藤甲素联合应用时，凋亡率上升到18.5％。
5.雷公藤甲素明显抑制P糖蛋白在K562/A02细胞的表达。罗丹明-123蓄积试验表明，雷公藤甲素能够抑制P糖蛋白功能。
6.K562细胞转染miR-21模拟物后，miR-21水平明显上升；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后，miR-21水平明显下降。K562细胞转染miR-21模拟物后，存活率明显升高；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后，存活率明显下降。
7.K562细胞转染miR-21模拟物后，PTEN蛋白水平明显下降；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后，PTEN蛋白水平明显上升。MiR-21降低K562细胞PTEN-3'编码序列荧光素酶报告基因活性。
8.PTEN siRNA显著降低K562细胞PTEN蛋白水平。K562细胞转染PTEN siRNA后，细胞存活率升高，而且P糖蛋白的表达升高。
9.雷公藤甲素能够有效抑制BCL-2在K562/A02细胞的表达。K562细胞转染miR-21模拟物后，BCL-2表达水平明显上升；K562/A02细胞转染miR-21抑制物后，BCL-2表达水平明显下降。
结论：
1.雷公藤甲素提高K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。
2.雷公藤甲素抑制miR-21在K562/A02细胞的表达，从而升高PTEN蛋白水平。
3.雷公藤甲素通过PTEN/AKT通路抑制P糖蛋白表达和功能。
4.雷公藤甲素通过调节miR-21水平，抑制BCL-2在K562/A02细胞的表达，提高阿霉素诱导的细胞凋亡。
白血病;耐药机制;雷公藤甲素;microRNA;信号通路;化疗敏感性
江苏大学
博士
临床检验诊断学
许文林
2012
中文
R733.7;R730.53
161
2012-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）