人CYP2C8野生型及CYP2C8*2、CYP2C8*3和CYP2C8*4突变体重组酶的表达及药物基因组学研究
本课题采用慢病毒介导的体外表达系统构建了表达CYP2C8蛋白的细胞系,同时应用杆状病毒-昆虫表达系统异源表达了人CYP2C8野生型蛋白质及CYP2C8*2、CYP2C8*3和CYP2C8*4三个功能变化的突变体蛋白质,比较了野生型蛋白质与突变体之间的代谢动力学参数;CYP2C8重组蛋白的成功表达为体外药物代谢和基因组学研究提供了单一的酶源。
目的：表达CYP2C8野生型蛋白质及CYP2C8*2、CYP2C8*3和CYP2C8*4三个突变体蛋白质,为药物代谢和基因组学的体外研究提供单一性的酶源;同时利用底物紫杉醇、瑞格列奈和布洛芬比较代谢动力学差异。
方法：以人肝组织RNA为模板进行RT-PCR扩增反应,获得CYP2C8基因的cDNA序列,然后通过定点突变获得三个突变体的cDNA序列。将这些基因添A连接至pMD19-T载体进行测序,选取正确序列的CYP2C8三个突变型基因连接至pCDH-EFI-MCS-T2A-copGFP或pFastBac质粒中。一方面,重组的pCDH-EF1-CYP2C8s-T2A-copGFP与包装系统共转染HEK293FT细胞产生重组慢病毒。再将重组的慢病毒感染HEK293FT细胞形成转基因细胞,经有限稀释法得到荧光较强的两株单克隆转基因细胞系HEK293FT-CYP2C8。采用Real-timePCR的方法检测转基因细胞中CYP2C8在mRNA水平上的表达情况。另一方面,将重组质粒pFastBac-CYP2C8s转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经过转座作用,产生重组粘粒(Bacmid-CYP2C8s)。将各重组粘粒转染Sf9细胞后,即产生重组杆状病毒。以Real-timePCR的方法测定v-CYP2C8、v-POR和v-Cytb三种病毒的浓度,通过比较三种病毒间不同的比例、不同的细胞感染复数值,以及不同的表达时间等条件下的重组酶活性,选取最佳表达条件。采用western-blot检测细胞是否表达了重组人CYP2C8蛋白质以及表达的水平。以紫杉醇、瑞格列奈和布洛芬作为底物,分别检测重组酶的活性,并比较CYP2C8野生型与突变体之间的代谢动力学参数。
结果：构建了两株荧光较强的HEK293FT-CYP2C8单克隆转基因细胞系,通过Real-timePCR实验证明其在mRNA水平上大量表达CYP2C8。通过杆状病毒昆虫表达系统表达了人CYP2C8野生型及CYP2C8*2、CYP2C8*3和CYP2C8*4突变体重组蛋白质,通过Westernblot实验证明目的蛋白质的成功表达。以CYP2C8经典底物紫杉醇、特征性底物瑞格列奈和布洛芬,对重组酶的代谢活性进行了比较。CYP2C8野生型及CYP2C8*2、CYP2C8*3和CYP2C8*4突变体重组酶对紫杉醇的代谢动力学参数Km分别为8.65、9.65、16.25和11.81μmol·L-1,Vmax分别为69.83、36.95、84.15和28.90pmol·min-1·pmol-1蛋白质;对瑞格列奈的代谢动力学参数Km分别为12.01、11.34、7.43和11.38μmol·L-1,Vmax分别为15.69、11.56、12.74和11.91*10-6U·min-1·pmol-1蛋白质;对R-布洛芬的代谢动力学参数Km分别为341.3、479.2、230.1和295.3μmol·L-1,Vmax分别为4.921、7.632、2.401和1.814*10-3U·min-1·pmol-1蛋白质;对S-布洛芬的代谢动力学参数Km分别为388.8、544.9、269.5和351.2μmol·L-1,Vmax分别为3.017、5.269、1.744和1.278*10-3U·min-1·pmol-1蛋白质。
结论：CYP2C8野生型与突变体蛋白的体外活性具有一定的底物依赖性和立体选择性。*4突变体对三种底物均表现出较野生型低的代谢活性;*2突变体对紫杉醇、瑞格列奈的代谢活性偏低,但对R型和S型布洛芬的清除率与野生型无差别;*3突变体对紫杉醇、R型和S型布洛芬的代谢活性较野生型低,却比野生型代谢瑞格列奈的活性高约30％;此外,野生型与各突变体对布洛芬对映体的立体选择性趋势一致,对R型布洛芬代谢活性显著高于S型。以上研究填补了CYP2C8体外代谢瑞格列奈、布洛芬研究的空白,为体外药物代谢和药物基因组学研究提供单一的酶源,该模型还可以用于药物代谢酶表型、代谢途径及代谢物、抑制剂研究等。
突变体;药物基因组学;杆状病毒表达系统;紫杉醇;瑞格列奈;布洛芬;代谢动力学
浙江大学
硕士
药学
曾苏
2012
中文
R917
92
2012-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）