单核细胞TLR7和TLR8的表达及功能与HIV感染关系的研究
目的：
近二十年来研究者们一直致力于获得性免疫对HIV感染的免疫应答研究,但到目前为止在免疫治疗和疫苗方面尚无突破性进展。近来研究显示,在HIV感染中天然免疫系统可能占有非常重要的地位。天然免疫系统即是机体抵御外来病原微生物入侵的第一道防线,同时又在调节获得性免疫中发挥着重要的作用,单核细胞是天然免疫系统的重要细胞,其表达具有高度同源性的Toll样受体7和8(Toll-LikeReceptor7 and8,TLR7和8),能够识别病毒单链RNA(ssRNA),活化核因子NF-κB,促进细胞因子IL-12p40、TNF-α等的分泌。最近研究发现TLR7和8能够识别HIV-1长末端重复序列(HIV-1 LTR)上富含尿嘧啶的ssRNA(ssRNA40)。单核细胞TLR7和8的表达是否与HIV感染的疾病进程有关,是否为HW感染者疾病进展缓慢的保护因素,目前尚无文献报道。TLR7和8的表达水平能否影响其介导的单核细胞分泌的细胞因子水平,亦无文献报道。TLR7和8介导的NF-κB的活化能够同时促进Ⅰ型和Ⅱ型细胞因子的产生,且在HIV-1 LTR上存在着NF-κB的结合位点,能够与NF-κB结合促进HIV的复制,可见单核细胞TLR7和8活化能够介导的双重作用,那么它如何影响HIV的复制呢?目前尚无明确的结论。本文首次研究了不同疾病进程的HIV感染者单核细胞的TLR7和8表达水平和其介导的细胞因子分泌功能以及对HIV复制的影响,初步探讨了HIV感染者单核细胞TLR7和8表达及其介导的信号对HIV感染疾病进程的影响及可能的致病机制。
方法：
1、研究对象
由辽宁省疾病预防与控制中心,河南省疾病预防与控制中心和中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实验室经Western blot试验确认为HIV阳性的HIV/AIDS患者。根据HIV/AIDS患者CD4+T细胞数量和感染时间不同,分成三组:缓慢进展组,CD4+T淋巴细胞≥500个/μl,感染HIV10年以上,未经抗病毒治疗,无艾滋病指征性症状;HIV感染组,CD4+T淋巴细胞≥200个/μl,无艾滋病指征性疾病;AIDS病组,CD4+T淋巴细胞＜200个/μl或出现艾滋病指征性疾病。HIV抗体阴性的健康对照来自本院健康体检门诊的体检者,血液系统及肝肾功能检查结果正常,无免疫系统000疾病史。
2、标本采集
用10毫升EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周静脉血,在6小时内进行试验。
3、T淋巴细胞绝对值和比值测定
将20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入绝对计数管中,应用反向加样法加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACSMULTISET软件检测并进行自动分析,计算CD4+T淋巴细胞绝对值。
4、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
离心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液14ml,沿管壁缓慢加入用PBS稀释后的抗凝全血30ml,离心400g,30min。用毛细管吸取界面层的PBMC,移入另一试管中。加入5倍体积的PBS缓冲液,洗细胞2次。
5、CD14+单核细胞分选
采用德国Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分选装置,严格按照说明书进行操作。每10M细胞加20μl抗CD14免疫磁珠,4℃结合15min,300g离心10 min,500μl缓冲液重悬细胞,经LS柱子进行阳性分选。取少量细胞加入20μl CD3-FITC、20μl CD14-PE及20μl CD4-PerCP,用流式细胞仪Cellquest软件检测分选细胞纯度。
6、单核细胞体外培养及刺激
将分选的单核细胞用含有1％PS,2mmol/L的L-谷氨酰胺,25mmol/L HEPES缓冲液,10％胎牛血清的RPMI1640调整浓度为1×106/mL,培养于48孔板中,所用的培养基及材料均不含内毒素。用2.5μg/ml的R848刺激单核细胞,于37℃5％的CO2孵箱中培养,对照组加入同体积的PBS,每个样本设3个复孔,24小时后收集上清和细胞.
7、制备细胞RNA
按照QIAGEN公司细胞RNA提取试剂盒的说明书进行操作,通过全自动紫外分光光度仪检测所得RNA的质量和浓度。
8、引物及探针的设计和合成
上述引物经BLAST分析,匹配率为100％。
9、标准品质粒的构建
逆转录反应按照TaKaRa公司试剂盒说明书进行,RT反应体系为总RNA500ng,随机引物Oligo dT(50μM)0.5μl,Random6 mers(100μM)0.5μl,5×PrimeScriptBuffer2μl,PdmeScript RT Enzyme Mix I0.5μl,用Rnase Free dH2O补齐10μl。反应条件为37℃15 min,85℃5see,4℃终止反应,所得cDNA-20℃冻存备用。利用上述引物进行RT-PCR扩增TLR7、TLR8和GAPDH,PCR产物胶回收纯化后克隆到pUCmT-vector,转化到大肠杆菌DH5α感受态菌中,蓝白筛选后获得阳性克隆,测序验证。纯化重组质粒,紫外分光光度计定量后根据分子量换算为分子拷贝数,稀释标准质粒,产生梯度浓度:109、107、105、103、10作为标准品质粒。
10、实时定量PCR
采用SYBR Green法,应用ABI7500荧光定量PCR仪进行定量检测,以GAPDH为内参照,标准曲线法进行定量。反应体系为25μl,其中SYBR Premix Ex Taq12.5μl,ROX Reference DyeII0.5μl,上下游引物各0.5μl,cDNA模板1μl,H2O10μl。反应条件为:95℃5sec,60℃34sec,40个循环,溶解曲线的条件为95℃15 sec,60℃1 min,95℃15 sec。反应结束后电脑用不同浓度标准品质粒的拷贝数和CT值自动绘出标准曲线,并可根据待测样本目的基因和内参基因的CT值计算出TLR7和TLR8mRNA的拷贝数。每一份标本均行复管检测,取其均值做为目的基因的表达水平。
11、TNF-α和IL-12p40的检测
采用ELISA方法,按照TNF-α和IL-12p40试剂盒的说明书进行操作,定量检测单核细胞培养上清中的TNF-α和IL-12p40的含量。
12、EasyQ测定HIV病毒载量
样本量200μl,检测范围为＞10U/ml.
13、统计学处理
所有资料采用SPSS11.5软件分析。符合正态分布的数据采用LSD检验对不同患者组和健康对照组进行两两比较,Pearson进行相关性分析,不符合正态分布的数据采用Mann-Whitngy U test进行比较,Spearman rank进行相关性分析,数据处理成均值±标准误,统计概率采用双侧检验,P＜0.05时有统计学意义。
结果：
1、HIV/AIDS患者外周血单核细胞TLR7和TLR8的mRNA表达
TLR7 mRNA的表达:缓慢进展组高于HIV感染组、AIDS组和健康对照组,有统计学意义(P＜0.05):HIV感染组高于AIDS组,有统计学意义(P＜0.05);健康对照组高于AIDS组,有统计学意义(P＜0.05);HIV感染组与健康对照组相比无统计学意义(P＞0.05);TLR8 mRNA的表达:缓慢进展组和健康对照组高于AIDS组,有统计学意义(P＜0.05);缓慢进展组高于HIV感染组,HIV感染组高于AIDS组,没有统计学意义(P＞0.05);缓慢进展组高于健康对照组,健康对照组高于HIV感染组,没有统计学意义(P＞0.05)。
2、HIV/AIDS患者单核细胞TLR7和TLR8 mRNA的表达水平与CD4细胞数量的相关性
63例HIV/AIDS患者单核细胞TLR7mRNA的表达水平与CD4+细胞数量呈显著正相关(r=0.614,P＜0.01);TLR8mRNA的表达水平与CD4+细胞数量呈显著正相关,(r=0.419,P＜0.01)。
3、TLR7和8介导的mV感染者单核细胞分泌TNF-α和IL-12p40
水平:
外周血单核细胞体外培养上清中未检测到TNF-α和IL-12p40。经TLR7和8的配体R848刺激后TNF-α和IL-12p40的分泌水平显著增加(P＜0.001)。健康对照组TNF-α的分泌水平为2708.9±370.3pg/ml,显著高于HIV感染组1776.04±479.46pg/ml(P=0.0412);健康对照组IL-12p40的分泌水平为393.8±25.7pg/ml,HIV感染组为519.74±87.9pg/ml,没有统计学意义(P=0.414)。
4、TLR7和8介导的单核细胞分泌TNF-α和IL-12p40的水平与CD4+T细胞绝对数的相关性
经Pearson相关分析得出,10例HIV感染者TLR7和8介导的单核细胞分泌TNF-α(r=0.864,P=0.0013)和IL-12p40(r=0.774,P=0.0086)的水平与CD4+T淋巴细胞绝对值呈明显正相关,且TNF-α与IL-12p40的分泌水平也呈明显正相关(r=830,P=0.003)
5、单核细胞TLR7和8经R848活化后表达变化
R848刺激单核细胞后TLR7表达明显下调(P=0.025,Wilcoxon秩和检验),TLR8表达没有明显变化(P＞0.05)。
6、单核细胞TLR7的表达水平与TNF-α和IL-12p40分泌水平的关系
HIV感染者单核细胞TLR7表达与其介导的TNF-α和IL-12p40的分泌水平没有相关性(P＞0.05)。单核细胞TLR7表达的下调水平与TNF-α和IL12-p40分泌水平也没有相关性(P＞0.05)。
7、单核细胞培养上清中HIV病毒载量与CD4+T细胞数量的关系
9例HIV感染者中,有6例HIV感染者单核细胞培养上清中出现低水平的HIV复制,3例未检测到HIV复制。为了解CD4+T细胞与HIV复制水平的关系,我们将6例出现HIV复制的HIV感染者按照CD4+T细胞数量分为两组(＞400/ml和＜400/ml),发现CD4+T细胞数＜400/ml组的HIV病毒载量显著高于CD4+T细胞数量＞400/ml组(P=0.031)。
8、R848刺激单核细胞TLR7和8后对单核细胞内HIV复制的作用
9例HIV感染者的单核细胞体外经R848刺激后有5例HIV复制水平显著降低(P=0.043,Wilcoxon检验),有1例HIV的复制升高,3例HIV感染者单核细胞经R848刺激前和刺激后均未检测出HIV复制。
结论：
1、HIV/AIDS患者不同疾病进程外周血单核细胞TLR7和TLR8表达水平不同,缓慢进展组高于HIV感染组,HIV感染组高于AIDS组;
2、HIV/AIDS患者外周血单核细胞TLR7和TLR8表达水平与CD4+T淋巴细胞绝对数明显正相关;
3、TLR7的活化能够引起自身表达的下调,TLR8的活化未引起自身表达的变化;
4、TLR7和8能够介导单核细胞分泌细胞因子,细胞因子分泌水平与机体的免疫状态有关。HIV感染者单核细胞TLR7和8介导的细胞因子分泌水平具有保护性调节作用;
5、HIV感染者外周血单核细胞中存在可复制的HW病毒颗粒,且复制水平与机体免疫状态有关;
6、HIV感染者单核细胞TLR7和8的活化能够抑制HIV复制,这种抑制作用不依赖于其它细胞。
人免疫缺陷病毒;单核细胞;TLR7;FLR8
中国医科大学
博士
临床检验诊断学
尚红
2008
中文
R593.302
66
2012-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）