二色补血草几丁质酶基因chi31和chi32原核表达及重组酶分析
几丁质酶(chitinase Ec.3.2.14)是一种能降解几丁质及其衍生物的糖基水解酶,它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解,从而抑制真菌的生长增殖,提高植物的抗真菌能力,它广泛存在于各种微生物、植物及动物细胞和组织中,参与多种生理过程。几丁质酶在生物防治和几丁质资源的利用等方面具有巨大的应用潜力,因而受到了广泛的重视。
二色补血草两个几丁质酶基因chi31和chi32已被克隆并提交到GenBank(cDNA的GenBank接受号分别为DQ431248和DQ431249)。本研究中利用实时定量RT-PCR技术研究了立枯丝核菌胁迫条件下,两基因在二色补血草中的表达模式。结果表明,chi31,和chi32基因能够应答真菌胁迫胁迫,两个内切几丁质酶基因对真菌病害的侵入均有防御反应。并且在同一组织中,两基因在表达上存在时间上的先后;在不同组织中,同一基因的表达量也存在差距。这说明,这两个基因可能在二色补血草中起到不同的作用,或分别隶属于不同的生物学途径。
利用表达型载体pET-52b(+)研究两个几丁质酶基因的功能,分别构建原核胞内表达载体pET-chi3lin和pET-chi32in。转化大肠杆菌BL21,获得转化子BL21-chi3lin和BL21-chi32in。IPTG诱导培养,通过对重组蛋白的SDS-PAGE检测,得到了重组蛋白的阳性菌株。利用改良的Schales法对转化子的酶活力进行测定,证实了重组酶CHI3lin和CHI32in的酶活性。并且对重组酶酶学特性进行了分析:重组酶CHI3lin最适酶促反应条件为Mn2+5mmol/L,温度40℃,pH值5.0。依照该体系以杨树叶枯病细胞壁为底物测得的重组酶CHI3lin发酵液粗酶活能达到0.772U。重组酶CHI32in最佳反应体系Ba2+5mmol/L,温度45℃,pH值5.0。依照该体系以杨树烂皮病菌细胞壁为底物测得的重组酶CHI32in发酵液粗酶活能达到0.792U。
进一步构建了原核胞外表达载体pET-chi3lex、pET-chi32ex。重组酶CHI3lex最适酶促反应条件为Zn2+5mmol/L,温度40℃,pH值5.0。依照该体系以杨树叶枯病细胞壁为底物测得的重组酶CHI3lex发酵液粗酶活能达到0.921U。重组酶CHI32ex最适酶促反应体系K+5mmol/L,温度45℃,pH值5.0。依照该体系以杨树烂皮病细胞壁为底物测得的重组酶CHI32ex发酵液粗酶活能达到0.897U。
在胞外原核表达中无论是在重组酶对真菌细胞壁的酶活还是对化合物的酶活都普遍高于胞内原核表达的重组酶的酶活。在胞内原核表达中,重组酶CHI3lin对杨树叶枯病细胞壁的酶活为0.499U,而在胞外原核表达中CHI3lex的酶活则高达0.921U。重组酶CHI32in对杨树烂皮病细胞壁的酶活为0.702U,而在胞外原核表达中则高达0.897U。这个结果也间接证明了胞外原核表达中的重组酶具有降解病原真菌细胞壁的潜力,为CHI3lex和CHI32ex在生防方向的应用提供了依据。而胞内原核表达中重组酶对疫酶的降解能力也有待于开发。
本研究获得的重组酶的生产基因工程菌株可以用于林农业的防病抗病工程,而且利用表达载体pET-52b(+)获得重组酶,能够减少病害防治的投入,降低林农业生产中的损失。同时本研究还为今后将几丁质酶基因转入植物基因组提供了有力的依据。
二色补血草;几丁质酶;chi31基因;chi32基因;RT-PCR技术
东北林业大学
硕士
遗传学
王秋玉
2010
中文
S436.8
79
2012-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）