斜卧青霉基因表达谱的差异分析研究
纤维素是自然界中丰富的可再生资源，在石油资源日益紧张的国际环境中，利用纤维素降解生产的生物燃料，作为一种可再生生物质能源已受到普遍关注。利用微生物产生的纤维素酶降解纤维类物质，反应条件温和，易于控制，对环境无污染，有利于促进人类社会的可持续发展，已广泛地应用于能源、纺织、造纸、印染、食品等多个行业。在产生纤维素酶的微生物中，丝状真菌能够分泌完整的纤维素降解酶组分，较细菌纤维素酶产量高，且易于分离，因此在纤维素酶生产菌的研究中以对丝状真菌最为集中。通过理化诱变、细胞融合等遗传操作方法选育和改良高产菌株，是提高丝状真菌的纤维素酶产量，改良纤维素酶系组分的有效方法。丝状真菌纤维素酶属于诱导型酶系，研究丝状真菌纤维素酶及其相关调节基因的表达调控机制，不仅具有重要的理论意义，而且为通过基因工程方法靶向改造菌株提供了背景资料，有利于提高纤维素酶的产量。
目前国内外主要围绕木霉和曲霉对丝状真菌纤维素降解酶类进行研究，已经在基因组学、转录组学以及蛋白质组学方面取得了一定进展，而对青霉的纤维素降解酶系研究较少。本论文从斜卧青霉在纤维素诱导与葡萄糖阻遏条件下基因组表达谱的差异出发，研究在诱导与阻遏条件下菌体基因表达的变化情况，为揭示纤维素酶的表达调控机制提供了丰富的数据资料。此外，我们还建立了斜卧青霉的表达系统，对在表达谱中得到的显著差异基因的功能进行了验证，为在斜卧青霉中进行基因工程改造奠定了基础。
本论文的主要研究结果如下：
1应用基于新一代Solexa测序的数字表达谱分析技术研究斜卧青霉诱导与阻遏条件下的基因表达差异
通过新一代Solexa测序技术的数字表达谱分析方法，我们构建了斜卧青霉在诱导与阻遏条件下的两个表达谱数据库。阻遏条件下总共得到了3，161，822条测序标签，其中包括230，285种不同的标签，诱导条件下得到了215，955种3，137，364条测序标签。两个表达谱数据库的比较结果显示，表达倍数变化大于1的表达标签共有114，548种，其中，在纤维素条件下上调(Ratio(W/G)>1)的表达标签有55，050种，下调(Ratio(W/G)<1)的表达标签59，498种。根据FDR<0.001且倍数差异在2倍以上作为显著差异的标准，我们得到了诱导条件下显著上调的表达标签4，051种，显著下调的表达标签6，595种。
将表达标签与斜卧青霉114-2基因组数据进行比对，结果显示，数据库W和G中分别有51.05％和55.15％的表达标签比对到参考基因上，未与参考基因比对上的标签进一步与基因组序列进行比对，其中又有37.83％和39.18％的表达标签得到比对，最终表达标签中大约有90％能够比对到斜卧青霉114-2基因组上。
分析比较比对后的表达谱数据库中的基因，以FDR<0.001并且变化倍数差异在2倍以上为显著差异表达标准，得到了在诱导与阻遏条件下，表达水平显著差异的基因2，396个，包括诱导条件下显著上调的924个基因和显著下调的基因1，472个。诱导条件下表达显著上调的基因包括多种木质纤维素降解酶类以及其它糖苷水解酶类基因，显示这些基因转录的共调控。对诱导条件下表达显著下调标签的注释显示，多个初级代谢相关酶类、转运蛋白、转录因子等基因显著下调表达。对差异基因进行基因功能富集性分析，结果表明，斜卧青霉114-2在诱导与阻遏条件下的基因表达以胞外木质纤维素降解酶基因最为显著。
2利用实时荧光定量PCR方法验证数字表达谱分析中得到的差异显著的纤维素酶基因及调节基因的表达变化水平
使用实时荧光定量PCR技术对斜卧青霉中关键的纤维素酶基因进行了转录水平分析。结果表明，在诱导条件下swo基因的转录水平上调最明显，提高了大约325倍，其次是cel7A基因提高了约149倍，cel7B基因转录水平提高了约109倍，cel5A基因和cel45A基因转录水平提高了相同倍数约58倍，而cel3A基因与其他基因的转录情况不同，转录水平在诱导条件时微弱下调了0.57倍。而在诱导条件下调节蛋白基因creA下调了0.47倍，ace1下调了0.60倍，xlnR下调了0.58倍，与纤维素酶基因相比，调控基因的变化幅度并不明显。这些变化结果与表达谱分析结果基本一致。通过与实时荧光定量PCR方法的比较，验证了数字表达谱分析技术在丝状真菌中用于纤维素酶基因及其调节基因转录分析的可信性。
另外，在两种分析方法中关于cel3A基因得到了相反的结果，RT-qPCR方法检测到的该基因表达水平变化趋势表现出与其他纤维素酶基因不同，对此，我们对斜卧青霉在两种条件下的β-葡萄糖苷酶活性做了进一步研究。结果显示，诱导条件下胞外β-葡萄糖苷酶活性显著高于阻遏条件下的酶活，且120 kDaβ-葡萄糖苷酶蛋白量较阻遏条件下更高。而阻遏条件下，胞内β-葡萄糖苷酶活性高于诱导条件下的胞内β-葡萄糖苷酶活。由此我们推测cel3A基因具有与其他纤维素酶基因不同的表达调控方式，可能存在蛋白的细胞定位水平调节。
3建立了斜卧青霉遗传操作系统，并成功表达瑞氏木霉来源的cel5A基因
为了在基因水平对斜卧青霉进行基因工程改良，我们建立了斜卧青霉遗传操作系统。使用5-氟乳清酸筛选得到了一株尿嘧啶营养缺陷型菌株斜卧青霉M12，并以此为宿主菌，用原生质体转化法，成功的将携带有瑞氏木霉来源的cel5A基因通过整合型载体ANIp7转化到斜卧青霉突变株M12中。酶活检测和蛋白质电泳活性染色分析表明，瑞氏木霉来源的cel5A基因成功地在斜卧青霉中得到活性表达，并且在葡萄糖阻遏条件下cel5A基因仍能正常表达。在诱导条件下，培养三天的转化子M12-ANIp7-cel5A滤纸酶活与对照相比大约提高了77％，CMCase活性与对照相比提高了约27％。在葡萄糖阻遏条件下，培养三天的转化子滤纸酶活约是对照的4倍，CMCase活达到了0.872 IU/ml，而非转化子在葡萄糖条件下几乎检测不到CMCase活性。
4构建了液泡型丝氨酸蛋白酶基因的敲除载体，尝试通过基因敲除的方法研究其功能
在对表达谱结果进行分析时，我们发现液泡型丝氨酸蛋白酶基因在纤维素诱导培养条件下显著下调。我们首先利用简并引物扩增得到了斜卧青霉液泡型丝氨酸蛋白酶基因的部分序列，进而通过TAIL-PCR和SEFA-PCR的方法扩增得到了基因全长及侧翼序列。在此基础上通过融合PCR的方法构建了该基因的敲除载体并进行了敲除实验。遗憾的是，我们尚未得到液泡型丝氨酸蛋白酶基因敲除的转化子。液泡型丝氨酸蛋白酶基因的敲除工作仍在进行中。
斜卧青霉;纤维素酶;数字表达谱分析;实时荧光定量法;真菌转化系统;基因敲除
山东大学
博士
微生物学
曲音波
2009
中文
Q93-33
140
2012-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）