5-羟色胺受体亚型在实验性近视眼形成中作用的研究
目的:探讨5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)在豚鼠近视离焦模型(Lens-inducedMyopia，LIM)形成中的作用；正常豚鼠与近视豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜5-HT2A、5-HT7、5-HT3受体亚型mRNA的表达差异，进而推断哪种受体亚型对近视眼球增长影响较大。一般通过形觉剥夺(Form Deprivation)或离焦(lens induce)来诱导实验性近视眼。有研究表明，各种动物出生后，眼球存在主动的正视化过程，其中最有说服力的例证是眼对透镜离焦所作出的代偿性眼球生长变化，表明正视化过程是有视觉依赖的，因此对豚鼠离焦近视机制的研究有利于对人类近视眼机制的探讨。
有研究表明，实验性近视眼形成过程中，会发生视网膜、脉络膜及巩膜的相应改变。而且在视网膜中的某些因子包括一些神经递质如多巴胺(Dopamine，DA)乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)[17-21]、γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)等及其它一些分子或生长因子都参与了近视的形成。近年来研究发现5-羟色胺(5-HT)与近视眼形成有关。二十世纪四十年代后期发现5-HT，到目前为止发现了11种5-HT受体亚型。不同的5-HT受体来调控5-HT的不同功能。有研究发现鸡形觉剥夺近视眼模型5-HT的代谢产物含量明显减少，推测5-HT可能作为一种神经递质参与了形觉剥夺近视的形成，但具体作用机制尚不清楚。本研究试图通过检测豚鼠实验性近视离焦组与对照组视网膜、脉络膜及巩膜内5-HT含量是否有差异及视网膜内5-HT2A、5-HT7、5-HT3受体亚型mRNA的表达是否有不同来探讨5-HT及其受体亚型在离焦性近视形成的机制。
方法:本实验分三部分：
实验一、离焦近视眼模型屈光状态、眼轴长度及巩膜形态学改变的研究。
将25只4周龄的豚鼠分成2组，离焦组(20只，40眼)，包括离焦实验眼(右眼，戴接触镜)和离焦对照眼(左眼，未戴接触镜)。空白对照组(5只，10眼)除检查外不做任何干预。所有豚鼠标记、编号。用火棉胶将中间嵌有PMMA接触镜尼龙子母扣固定在实验组右眼前。离焦14天后摘掉镜片。离焦前后分别对所有豚鼠进行检影验光及A超测量眼轴长度。之后，分别处死实验组及空白对照组豚鼠，立即取出眼球，在手术显微镜下将眼球在锯齿缘处剖开，虹膜恢复器剥离开玻璃体、视网膜、脉络膜后取赤道部巩膜，2.5％戊二醛液中固定，按常规透射电镜标本处理程序进行脱水、浸透、环氧树脂包埋，做500-600A°超薄切片，醋酸铀-拘橼酸铅染色，然后进行透射电镜观察并摄影。
实验二、应用高效液像色谱测定离焦近视眼模型视网膜、脉络膜及巩膜内5-HT的含量。
将24只4周龄的豚鼠分成2组，离焦组(18只，36眼)，包括离焦实验眼(右眼，戴接触镜)和离焦对照眼(左眼，未戴接触镜)。空白对照组(6只，12眼)除检查外不做任何干预。所有豚鼠标记、编号。14天后，分别处死实验组及空白对照组豚鼠，立即取出眼球，无菌操作，锯齿缘处切开眼球，将前段眼组织和玻璃体除去，用角膜钻取直径8mm的后极部眼组织块置于冰冷的PBS液中，手术显微镜下快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，将上述组织快速置于灭菌的Eppendorf管中，标号后快速放入液态氮中保存，冷冻后移入-70℃冰箱中储存待用。取离焦组的冰冻视网膜、脉络膜及巩膜组织标本，称重、匀浆、离心后利用高效液相色谱测定样品标本(视网膜、脉络膜及巩膜)内5-HT含量。
实验三、5-HT2A、5-HT7、5-HT3受体亚型在离焦近视眼模型视网膜、脉络膜及巩膜中的表达。
将24只4周龄的豚鼠分成2组，离焦组(16只，32眼)，包括离焦实验眼(右眼，戴接触镜)和离焦对照眼(左眼，未戴接触镜)。空白对照组(8只，16眼)除检查外不做任何干预。所有豚鼠标记、编号。14天后，分别处死实验组及空白对照组豚鼠，立即取出眼球，无菌操作，手术显微镜下锯齿缘处切开眼球，将前段眼组织和玻璃体除去，虹膜恢复器快速分离出视网膜、脉络膜及巩膜组织，快速置于灭菌的Eppendorf管中，标号后快速放入液态氮中保存，冷冻后移入-70℃冰箱中储存待用。利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测正常及近视豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜内5-HT2A、5-HT7、5-HT3受体亚型mRNA的表达，计算mRNA相对含量，作统计学分析。
统计学处理：采用均数差异t检验的方法对空白对照组与离焦实验组及离焦对照组之间进行差异的显著性分析。采用SPSS11.4软件。
结果:
实验一、屈光检查、眼轴测定及巩膜形态学变化结果。
1、4周龄豚鼠离焦14天后，离焦眼形成了高度近视(-8.69±0048D)，眼轴长度增长(7.60±0.04mm)，与对照眼的屈光度(-0.20±0.59D)和眼轴长度(7.07±0.05 mm)相比，差异有显著性(p<0.01)。
2、4周龄豚鼠离焦14天后，其后极部巩膜的纤维密度明显小于空白对照眼，且纤维母细胞内出现空泡变性。
实验二、离焦实验眼、离焦对照眼及空白对照眼视网膜、脉络膜及巩膜中5-ht含量的变化。
1、5-HT在豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜中均有表达，其中脉络膜含量最高(342.20±40.68 ng/g)，其次为巩膜(142.95±12.87 ng/g)及视网膜(37.28±9.95ng/g)。
2、离焦后豚鼠近视模型眼视网膜5-HT含量(48.74±4.52 ng/gVS39.09±8.67ng/g)(p<0.01)，脉络膜(451.56±32.82 ng/g VS374.45±17.72 ng/g)(p<0.01)巩膜中(269.16±41.49ng/g VS147.38±20.18 ng/g)(p<0.01)5-HT含量均明显升高。
实验三、5-HT2A、5-HT3、5-HT7受体亚型在离焦近视眼模型视网膜、脉络膜及巩膜中的表达。
1、5-HT2A、5-HT3受体亚型在视网膜、脉络膜及巩膜中有表达；5-HT7受体亚型在视网膜、脉络膜及巩膜中未见表达。
2、与空白对照组及离焦对照组比较，离焦实验组豚鼠视网膜(0.561±0.024VS0.544±0.008 VS1.238±0.014)、脉络膜(0.586±0.013 VS0.604±0.007 VS1.310±0.012)及巩膜(0.597±0.028VS0.617±0.012 VS0.890±0.014)内5-HT2AmRNA表达均明显上调(P<0.01)。
3、与空白对照组及离焦对照组比较，离焦实验组豚鼠视网膜(1.217±0.020VS1.212±0.021VS1.143±0.013)、脉络膜(1.176±0.013VS1.095±0.021VS1.185±0.016)及巩膜(1.111±0.021 VS1.127±0.013 VS1.063±0.014)内5-HT3mRNA表达无明显变化(P>0.01)。
结论:
1、5-HT在豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜中均有表达，其中脉络膜含量最高，其次为巩膜及视网膜。离焦后豚鼠近视模型眼视网膜、脉络膜及巩膜5-ht含量均明显升高。说明5-ht参与了离焦近视的形成过程。
2、不同视环境中，5-HT2A、5-HT3受体亚型在视网膜、脉络膜及巩膜内有表达；5-HT7在视网膜、脉络膜及巩膜内未见表达。离焦实验组豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜内5-HT2A mRNA表达均明显上调，5-HT3 mRNA表达无明显变化，说明5-HT通过与5-HT2A结合来参与离焦近视模型的形成。
实验性近视眼;5-羟色胺;5-羟色胺受体亚型;mRNA表达;形觉剥夺;离焦近视机制
中国医科大学
博士
眼科学
徐艳春
2008
中文
R778.11;R363.25
65
2012-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）