阿特拉津与氨苄青霉素单抗制备、鉴定及ELISA方法的初步建立
食品安全和人类的健康息息相关，而在食品安全中农兽药的残留检测又是重中之重。本研究制备了具有代表性的三嗪类农药--阿特拉津、β-内酰胺类兽药--氨苄青霉素的单克隆抗体，对抗体进行了纯化和性质鉴定，并对纯化后抗体的应用进行了初步研究。为进一步的检测工作奠定了基础。
本研究的目的是制备高特异性的阿特拉津、氨苄青霉素单克隆抗体。实验内容主要包括半抗原的改造及鉴定、完全抗原的合成及鉴定、实验动物的免疫、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立、单克隆抗体的制备、纯化、性质鉴定及ELISA检测方法的初步建立等。
本研究首先将阿特拉津进行羧基化修饰，用3-巯基丙酸取代阿特拉津结构上的氯原子，并对羧基化的阿特拉津运用红外光谱、核磁共振氢谱及质谱进行鉴定。用DCC法将羧基化阿特拉津与载体蛋白BSA、OVA偶联，对获得的完全抗原进行紫外光谱扫描及SDS-PAGE鉴定。计算人工合成完全抗原的偶联比为AT：BSA=20:1。
用生物合成法将氨苄青霉素与载体蛋白BSA、OVA偶联，用紫外光谱扫描及SDS-PAGE等方法对获得的完全抗原进行鉴定。计算人工合成完全抗原的偶联比为Amp：BSA=12.1:1。
实验动物的免疫采用完全抗原与等量弗氏佐剂(FA)混合，小剂量中程免疫的方法免疫8周龄雌性Balb/C小鼠，免疫间隔时间为两周。
首次免疫用完全抗原和等量弗氏完全佐剂混合乳化，腹腔单点注射，之后的免疫用完全抗原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化，第一次免疫AT-BSA40μg/只、Amp-OVA50μg/只，第二次AT-BSA50μg/只、Amp-OVA60μg/只，第三次免疫AT-BSA70μg/只、Amp-OVA70μg/只，第四次免疫AT-BSA70μg/只、Amp-OVA80μg/只，20 d后融合前免疫用不加佐剂的完全抗原AT-BSA160μg/只、Amp-OVA160μg/只。分别在第二次、第四次免疫后断尾取血，间接ELISA测定抗血清的效价，竞争ELISA测定抗血清的竞争活性，结果抗血清效价均达到或高于1:100000且具有竞争活性。
用50％的聚乙二醇(PEG4000)将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合，用HAT进行选择性培养，间接ELISA筛选阳性克隆细胞株，扩大培养后筛选有竞争活性的细胞株，经过两次有限稀释法亚克隆后阳性率达100％，筛选得到4株分泌阿特拉津单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为：C7B1A12、C7B1C9、C7B1F3、C12A4D10；3株分泌氨苄青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为：H3D1H；2、H3D1B2、H3D1C9。
各单细胞株进行多次传代培养，取不同批次的分泌抗体用间接ELISA测定其分泌抗体的稳定性，Giemsa染色对其染色体进行分析，确定获得了稳定分泌目标抗体的杂交瘤细胞株。
以石蜡油为诱导剂进行腹水型单克隆抗体的制备。
对抗体性质进行系统鉴定：(1)单克隆抗体效价的测定；(2)单克隆抗体特异性的检测；(3)单克隆抗体亲和常数的测定；(4)单克隆抗体免疫球蛋白亚类的鉴定。
阿特拉津单克隆抗体性质综述如下：间接ELISA测定效价均达到或高于1:240000。通过与结构及功能类似物西玛津、三聚氰胺、毒死蜱、久效磷、对硫磷等的交叉反应对抗体灵敏度进行检测，结果表明四株单抗对毒死蜱、久效磷、对硫磷的交叉反应率均小于0.01％。细胞株C7B1A12分泌的抗体对三聚氰胺的交叉反应率为0.043％，其余三株细胞株分泌的抗体对三聚氰胺的交叉反应率均不高于0.01％。细胞株C7B1A12、C12A4D10、C7B1C9与C7B1F3分泌的抗体对西玛津的交叉反应率分别为21.29％、80.33％、17.23％、84.77％，交叉反应率较高的原因可能是阿特拉津与西玛津的结构极其类似。间接ELISA求得抗体的亲和力常数：细胞株C7B1A12、C781C9、C781F3、C12A4D10的亲和力常数分别为：2.76×1011、2.97×1011、3.04×1011、2.13×1011L/mol。利用Sigma单克隆抗体免疫球蛋白亚类(Ig)鉴定试剂盒得到抗体的免疫球蛋白亚类：细胞株C7B1A12、C7B1C9、C781F3、C12A4D10的免疫球蛋白亚类分别：IgG1、IgG1、IgG1、IgG2b。通过对阿特拉津抗体的性质鉴定认为，获得了高特异性、高亲和力的阿特拉津抗体，其中细胞株E7B1A12、C7B1C9、C7B1F3分泌的抗体性质略优于细胞株C12A4D10分泌的抗体，C7B1C9分泌的抗体性质优于C7B1A12、C7B1F3。建立四株单抗的标准曲线并初步建立阿特拉津残留检测的ELISA分析方法：根据棋盘滴定的实验结果，选择包被量为0.625μg/mL、抗体1:10000稀释进行竞争ELISA实验。竞争实验得到四株单克隆细胞株C7B1A12、C7B1C9、C7B1F3、C12A4D10标准曲线的回归方程分别为I=37.28logC+120.39，R2=0.9847；I=36.26logC+120.77，R2=0.9856：I=36.07 logC+119.13，R2=0.9857；I=33.29logC+124.9，R2=0.9926。四株单细胞株C7B1A12、C7B1C9、C7B1F3、C12A4D10的检测范围分别为0.9～0.001μg/mL；0.9～0.001μg/mL；0.9～0.001μg/mL；0.9～0.004μg/mL。最低检测限分别为IC20=0.0020μg/mL；IC20=0.0017μg/mL；IC20=0.0018μg/mL；IC20=0.007μg/mL。灵敏度分别为：IC50=0.013μg/mL；IC50=0.01μg/mL；IC50=0.012μg/mL；IC50=0.056μg/mL。四个单细胞株的最低检测限均达到了ng级别。其中，单细胞株C7B1A12、C7B1C9、C7B1F3分泌的抗体的灵敏度优于细胞株C12A4D10。
氨苄青霉素单克隆抗体性质综述如下：间接ELISA测定氨苄青霉素单克隆抗体的效价均达到或高于1:64000。通过与结构及功能类似物青霉素-G、链霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶等的交叉反应得到三株单细胞株的特异性检测结果，三株单细胞株分泌的抗体对青霉素-G、链霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶的交叉反应率均低于0.01％。间接ELISA实验求得抗体的亲和力常数。细胞株H3D1H1、H3D1B2、H3D1C9分泌的抗体亲和力常数分别为：12.37×109、8.96×109、9.03×109L/mol。利用Sigma单克隆抗体免疫球蛋白亚类(Ig)鉴定试剂盒得到抗体的免疫球蛋白亚类，H3D1H1、H3D1B2、H3D1C9分泌抗体的免疫球蛋白亚类类型均为IgGl。通过对三株分泌氨苄青霉素抗体的细胞株分泌的抗体的性质鉴定可以认为，获得了高特异性、高亲和力的阿特拉津抗体，其中H3D1C9分泌的抗体性质优于H3D1B2、H3D1H1。建立三株单抗的标准曲线并初步建立氨苄青霉素残留的ELISA分析方法：根据棋盘滴定的实验结果，选择包被量为0.625μg/mL、抗体1:10000的稀释进行竞争实验。竞争实验得到三株单克隆细胞株H3D1H1、H3D1B2、H3D1C9标准曲线分别为I=35.163logC+116.05，R2=0.9829；I=36.065logC+121.12，R2=0.9768；I=33.865logC+113.67，R2=0.9941。三株单细胞株H3D1H1、H3D1B2、H3D1C9的检测范围分别为0.094～0.0018μg/mL；0.072～0.0015μg/mL；0.101～0.0017μg/mL。最低检测限分别为IC20=0.00185μg/mL；IC20=0.0015μg/mL；IC20=0.0017μg/mL。灵敏度分别为：IC50=0.013μg/mL；IC50=0.0106μg/mL；IC50=0.013μg/mL。三个单细胞株的最低检测限均达到了ng的级别。其中，单细胞株H3D1C9分泌的抗体灵敏度要优于细胞株H3D1H1、H3D1B2。
本研究在制备人工结合完全抗原和动物免疫的基础上利用杂交瘤技术，筛选得到了抗AT、Amp的高特异性、高灵敏度、高亲和力McAb，并初步建立了ELISA检测方法。经纯化的单克隆抗体可以分别应用于阿特拉津、氨苄青霉素残留的快速检测，为动植物食品中阿特拉津、氨苄青霉素残留的快速、灵敏、简便的检测技术的建立奠定了基础，进而为我国农兽药残留监控提供了技术支持。
阿特拉津;氨苄青霉素;单克隆抗体;残留检测;食品安全;生物合成法
解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院
硕士
营养与食品卫生学
高志贤
2010
中文
TS207.53
101
2012-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）