一种肺炎链球菌体磷壁酸合成相关蛋白SPD1672功能研究
背景：本课题组前期工作从肺炎链球菌中筛选到一些体内诱导基因,这些体内诱导基因可能与细菌感染致病有关。Spd1672基因是其中的一个体内诱导基因,经过生物信息学分析,其表达产物SPD1672蛋白含有脂质A核心-O抗原连接酶结构域,提示该基因可能与细菌细胞壁多糖形成相关,本课题拟对spd1672基因功能进行鉴定,探寻它影响细胞壁多糖合成的生物学证据,并进一步研究其在感染致病过程中的毒力机制。
方法：首先通过基因替代失活法构建肺炎链球菌spd1672基因缺陷菌(D39△1672);通过透射电子显微镜对细菌荚膜厚度进行观察;通过C反应蛋白结合实验及补体C3沉积实验观察细菌磷壁酸合成量改变,并进一步对细胞壁原生质及细胞壁壁进行分离,通过western blot确证野生菌与缺陷菌壁磷壁酸(WTA)及脂磷壁酸(LTA)合成量变化情况。通过增加Mg2+浓度改变培养基渗透压,观察野生菌与缺陷菌对高渗环境的耐受能力。用小鼠毒力实验比较spd1672缺陷菌与野生菌的毒力改变:并通过体内定植实验、杀菌实验、细胞因子测定等研究方法,对spd1672影响肺炎链球菌毒力的机制进行初步探讨。
结果：D39△1672较D39在体外培养条件下生长能力减弱,通过透视电子显微镜观察,D39△1672与D39荚膜厚度并无明显改变。C反应蛋白结合实验结果显示D39△1672结合CRP量较D39明显减少。而补体C3沉积实验结果显示D39△1672结合补体C3量较D39明显减少。进一步利用抗磷壁酸抗体对两种细菌磷壁酸合成量进行western blot分析后发现,D39△1672较D39菌WTA和LTA合成量菌明显减少。改变生长培养基的离子浓度后发现,在加入50mM Mg2+条件下,D39△1672的增殖速率较正常培养基中明显提高(P＜0.05),而对D39并无明显影响,而在100mM、200mM Mg2+条件下,D39△1672的增殖受到显著抑制(P＜0.05),而D39仅受轻微影响(P＞0.05)。通过腹腔途径感染小鼠,结果显示D39△1672毒力较D39菌明显减弱,其感染小鼠后入血菌量较D39明显减少(P＜0.05),在鼻咽部、肺部定植数也较D39显著减少(P＜0.05)。全血杀菌实验结果显示D39△1672对白细胞的杀菌作用抵抗力较D39显著减弱(P＜0.05)。通过对细胞因子测定,结果发现D39感染的小鼠较D39△1672诱导更高水平的IL12、TNF-α。
结论：通过本研究显示spd1672基因是影响磷壁酸合成的关键基因,该基因缺失后,会引起细菌磷壁酸合成显著减少。同时该基因缺陷后,细菌生长增殖能力减弱;对宿主定植、侵袭能力减弱;对白细胞杀菌效应的抵抗力减弱;并对Mg2+渗透压等外界环境改变更为敏感,提示该基因是细菌感染致病过程中的一个重要的毒力因子。
肺炎链球菌;菌体;磷壁酸;合成;相关蛋白;体内诱导基因;细菌感染;实验结果;细胞因子测定;细胞壁;感染致病;毒力
重庆医科大学
硕士
临床检验诊断学
张雪梅
2011
中文
R378.14
56
2012-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）