LP-PLA2的原核表达、抗体制备及表位分析
脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)属于ⅦA型磷脂酶A2,它可以预测与冠脉事件有关的动脉粥样硬化和中风危险。目前,在国内,LP-PLA2临床诊断试剂主要依赖于从国外进口,所需费用昂贵,限制了该检测项目在我国的推广及应用,因此,研发LP-PLA2体外免疫诊断试剂尤为重要。
目的：本研究旨在获取人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白,制备相应抗体,同时验证经生物信息学预测的表位肽的抗原性,为LP-PLA2体外免疫诊断试剂的研发奠定基础。
方法：采用Trizol法从分化的THP-1细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段LP-PLA2;利用分子克隆技术构建原核表达质粒;转化入大肠杆菌BL21(DE3),优化诱导表达条件,进行多步骤纯化并除去标签,获得目的蛋白,免疫新西兰大白兔,制备抗LP-PLA2的多克隆抗体;运用多种生物信息学方法对LP-PLA2抗原表位进行预测,并用纯化的LP-PLA2多克隆抗体鉴定其抗原性。
结果：
1.成功构建了PET-28a(+)-LP-PLA2,PGEX-4T-2-LP-PLA2,pColdTF-LP-PLA2等重组表达质粒。
2.经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳显示:LP-PLA2在PET-28a(+)-LP-PLA2表达载体中不表达;在PGEX-4T-2-LP-PLA2表达载体中少量表达,且主要以包涵体形式存在;在pCold TF-LP-PLA2表达载体中,获得表达量较高的融合蛋白,主要以上清形式存在。
3.将pCold TF-LP-PLA2诱导表达上清经镍柱亲和层析纯化后,获得TF-LP-PLA2重组蛋白,将该重组蛋白用HRV-3C prolease酶切后,用蓝胶分离纯化,获得了纯度约为90％、分子量约为45kD的蛋白,与预期相符,且该蛋白能够被市售的LP-PLA2多克隆抗体识别,证明获得了纯度较高的LP-PLA2目的蛋白。
4.制备了抗LP-PLA2的多克隆抗体,抗体效价＞1:5.12×106,Western blot结果表明,该抗体特异性较高。
5.运用生物信息学软件综合分析预测了LP-PLA2的三段表位肽,体外抗原抗体免疫反应实验证实了三段表位肽均具有良好的抗原性。
结论成功表达并纯化获得了高纯度的LP-PLA2蛋白;制备了效价和纯度均较高的LP-PLA2多克隆抗体;运用生物信息学分析方法预测了LP-PLA2的三段表位肽,并证实了其具有良好的抗原性,可用于进一步制备多克隆和单克隆抗体。本研究为LP-PLA2体外诊断试剂的研发奠定了基础。
原核表达质粒;抗体制备;多克隆抗体;脂蛋白相关磷脂酶;生物信息学预测;诱导表达;免疫诊断试剂;抗原性;表位肽;表达载体;亲和层析纯化;重组蛋白
重庆医科大学
硕士
临床检验诊断学
胥文春
2011
中文
R446.6;R392
68
2012-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）