黄芪甲苷对镉致大鼠睾丸支持细胞损伤的保护作用
目的:探讨镉对大鼠原代培养睾丸支持细胞的细胞生长活性、超微结构、相关蛋白表达和信号分子的影响,以及黄芪甲苷的拮抗作用和可能机制。
方法:采用18天龄清洁级健康SD雄性大鼠,无菌操作取出大鼠睾丸,再剪碎,依次用0.25％胰蛋白酶、0.05%V型胶原酶进行消化,制成单细胞悬液,培养24小时,再经Tris-Hcl处理后,得到纯度近95%的支持细胞。空白对照组、0.5%二甲基亚砜(DMSO)组、镉(50μmol/L)组、镉(50μmol/L)加黄芪甲苷(分别为5、10、20mg/L)组的培养支持细胞用于四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞生长活性实验,其中DMSO组用于验证0.5%DMSO溶剂是否对细胞有毒害作用;镉(50μmol/L)加不同浓度黄芪甲苷组用于筛选最佳保护作用的黄芪甲苷浓度。空白对照组、镉组、镉加最佳浓度黄芪甲苷组的培养细胞分别再用于超微结构观察、波形蛋白和E-钙粘连蛋白/β-环连蛋白免疫组织化学及信号传导分子磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)的检测。
结果:电镜下正常原代培养细胞形态特征:细胞多呈不规则形,细胞膜向外形成较多突起,核不规则、核被膜常有高度返折,核内常染色质丰富,异染色质较少,多位于核膜内侧,核仁明显,可数个,胞质内线粒体、高尔基复合体、内质网等细胞器丰富,局部胞质区域可见明显微丝聚集,符合大鼠睾丸支持细胞形态特点。24h和48h MTT细胞生长活性显示空白对照与DMSO组差异无统计学意义,镉组较空白对照组细胞活性明显减弱,镉加黄芪甲苷(10mg/L)组保护作用最佳,其中24h时镉加黄芪甲苷(10mg/L)组的细胞活性虽低于对照组但明显高于镉组;48h时镉加黄芪甲苷各组的细胞活性均高于镉组。镉处理后,支持细胞超微结构改变表现为:线粒体内室肿胀,溶酶体增多,核旁多量脂滴堆积,内质网不同程度扩张或形成不规则的大空泡,髓样结构形成。部分损害严重的细胞可见整个细胞胞质电子密度降低,细胞器崩解,细胞核染色质边集、凝聚或核溶解。此外有少许支持细胞出现凋亡现象,可见凋亡小体形成;镉加黄芪甲苷(10mg/L)处理组支持细胞超微结构损伤改变较镉组为轻。波形蛋白、E-钙粘连蛋白和β-环连蛋白免疫组织化学结果显示:对照组,波形蛋白呈棕黄色阳性反应,密集环绕于细胞核周围形成网状结构,少数可见棕黄色阳性产物贯穿细胞核。镉处理后胞质内阳性反应产物表达较对照组明显减弱,稀疏分布于细胞核周围。黄芪甲苷组胞质内反应产物表达虽较对照组减弱,但较镉组表达明显增强(P＜0.05);E-钙粘连蛋白和β-环连蛋白的结果与波形蛋白表达结果相似。P-p38MAPK检测结果显示:对照组P-p38MAPK阳性产物呈棕色,稀疏分布于胞质或核周。镉处理后阳性产物表达明显增强,且分布位置有向细胞核转移的趋势,核内亦可见棕色阳性产物。镉加黄芪甲苷(10mg/L)组阳性产物虽较对照组增多但明显少于镉组(P＜0.05)。
结论:镉可以导致原代培养大鼠睾丸支持细胞的细胞生长活性受抑制,细胞超微结构损伤,细胞骨架蛋白及粘连蛋白(波形蛋白、E-钙粘连蛋白和β-环连蛋白)表达下降,并使信号传导分子(P-p38MAPK)表达增强。黄芪甲苷对镉引起的支持细胞结构和功能损伤有较明显的拮抗作用,其保护机制可能与减少p38MAPK的磷酸化,并与增强钙离子同镉的竞争力,减少细胞内钙离子浓度,抗氧化等途径有关。
黄芪甲苷;大鼠睾丸;细胞损伤;睾丸支持细胞;对照组;细胞生长活性;p38MAPK;钙粘连蛋白;超微结构损伤;波形蛋白;空白对照;环连蛋白
重庆医科大学
硕士
人体解剖与组织胚胎学
廖晓岗
2011
中文
R285.5;R697.22
45
2012-04-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）