力学环境下组织工程骨的构建与动态培养
目的:
1.依据仿生原理制备一种新型的胶原多糖基纳米HA复合骨支架材料,并与成骨细胞复合培养,检测其细胞相容性,为其将来在骨组织工程中和临床上的应用提供实验依据。
2.设计并构建一套用于组织工程骨或骨组织在体外三维灌流培养和动态载荷生物反应器并测试其性能,为体外组织工程骨的动态培养和三维条件下进行骨细胞生物力学研究提供一种可靠的培养装置与研究平台。
3.初步研究组织工程骨在循环灌流和动态压应变载荷下的力学效应,从而为考察力学刺激在组织工程骨的构建和培养过程中的作用机理,以及为将来进一步从细胞和分子水平方面研究各种压应变载荷条件下的细胞生物学行为与作用机理提供一些实验参考依据。
方法:
1.称取6.0g牛Ⅰ型胶原与600mg透明质酸钠(胶原与透明质酸钠的质量比为10:1),用0.1％稀醋酸稀释,在室温下搅拌混合30min。加入碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS),控制pH值在4.75左右交联反应2h后,分别用40％的酒精、0.1mol/L的Na2HPO4(PH9.1),1mol/L的NaCl清洗,去离子水漂洗10遍。以胶原分子与透明质酸交联的产物为模板,调制钙磷盐在液相中沉积其上,得到矿化胶原多糖基复合材料(nHACP)。采用液相分离法与少量聚乳酸复合进一步制备成为三维多孔支架材料(nHACP/PLA scaffold)。用x-ray衍射、扫描电镜等对材料成分和支架形貌进行分析和测试,观察和测量支架的孔径、孔隙率和交通孔的大小。测定37℃下支架材料的2h吸水率。用万能材料测试机测定支架在饱和湿度条件下的抗压强度和经体外降解1、10、20d后的力学性能改变。
2.将成骨前体细胞MC3T3-E1直接接种到胶原多糖基纳米HA复合骨支架支架材料上,培养液为α-MEM培养基,加入10％胎牛血清,100 mg/L青霉素和100 U/L链霉素,分别于共培养1、3、5、7、9d后,采用CCK-8细胞计数试剂盒(Cell Cuonting Kit-8,CCK-8)检测材料上成骨细胞生长、增殖情况。测定支架上MC3T3-E1细胞内的碱性磷酸酶(ALP)活性,并与在培养皿上培养的细胞作对照比较。用倒置相差显微镜、组织化学染色、荧光显微镜、扫描电镜等观察细胞在支架材料上的生长形态和细胞外基质分泌情况。
3.设计一套动态载荷与循环灌流生物反应器系统。首先明确动态载荷与循环灌流生物反应器的设计原则；分别设计了应变加载系统和三维灌流培养系统。应变加载系统由刚性框架、智能型封装压电陶瓷置和压电陶瓷伺服器构成；三维灌流培养系统由培养舱、培养液储存罐、多通道双向蠕动泵和连接管组成；设计供三维灌流与加载专用的培养舱。按设计方案构建一套生物反应器样机,装配并运行反应器系统后进行测试:①置于5％CO2和37℃恒温培养箱内,每天移至超净台中进行应变加载2h,连续运转5d,每天抽取培养液加入到血培养瓶中作细菌培养,测定其无菌性能；②分别测定蠕动泵的单个灌流通道在不同转速时的平均流量；③将组织工程支架试件装入培养舱内,移至压电陶瓷加载装置上实施加载,发送各种指定的频率、位移和工作时间等指令,观察并记录计算机操作界面中实时显示所采集到的频率、位移和波形和工作时间等实际工作数据与设定数据的偏差,检测反应器系统运行的稳定性和可靠性。
4.采用MC3T3-E1细胞接种于nHACP/PLA支架上构建组织工程骨。以α-MEM培养基加入10％的胎牛血清(FBS)进行培养,置于37℃、5％CO2培养箱中。4h后将组织工程化模块进行分组,静态培养组:培养物置于直径10mm的培养皿内静态培养；灌流培养组:培养物置于生物反应器培养舱内灌流培养,灌流速度为以10 mL/min；灌流培养+应变加载组:在灌流培养组的基础上对培养物动态施加微应变刺激(加载条件为:3500με,1Hz,每次2h,1次/d)。采用CCK-8细胞计数试剂盒(Cell Cuonting Kit-8,CCK-8)检测培养5d、10d后各组支架材料上成骨细胞的吸光度(OD值,λ=450 nm)。于培养后10d取出各组培养物。测定各组细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性。采用组织切片和扫描电镜观察各组培养物内的细胞分布及形态。组织工程骨经静态培养10天后,置于加载装置下进行连续加载3h(加载条件:3500με,1Hz),加载完成12h后,分别用RT-PCR和Western-blot法检测动态应变加载对成骨细胞分化标志基因mRNA(Col I,OPN和OCN)表达水平和蛋白表达水平的影响。
结果:
1.所制备的胶原多糖基纳米HA仿生复合材料的晶粒度较低,晶体极为细小,与天然骨中羟基磷灰石的组装结构类似；该复合支架为多孔状,孔隙率约82％,孔径大小为200μm-650μm,单孔呈类圆形或不规则方园形。该仿生复合骨支架在37℃、饱和湿度条件下的杨氏弹性模量为6.834±0.404MPa,与与天然松质骨的弹性模量相接近。在37℃孵育降解1、10、20d后,其弹性模量分别为5.785±1.887MPa、2.532±0.194MPa和2.333±0.384MPa。支架材料在37℃下的2h吸水率为134%±24％。具有良好的孔径、孔隙率、吸水性能和抗压性能。
2.CCK-8检测结果提示,MC3T3-E1细胞与支架复合培养的9d内,随着培养时间的延长其CCK-8吸光度(OD值)逐渐增高,5d后增长曲线趋向平缓,提示MC3T3-E1成骨细胞能在复合支架材料上生长、增殖,5d后进入相对生长平台期。在复合培养3d后nHACP支架组的ALP活性较对照组明显增高,提示对nHACP支架MC3T3-E1细胞ALP活性的影响表现为促进作用。支架材料与细胞混合培养7d后形态学观察,可见钙从材料块上释放并在其周围形成钙浓聚区,成骨细胞聚集在其周围生长,具有向材料聚集的生长趋势。组织切片和电镜扫描可见MC3T3-E1细胞在支架上贴附、生长,并有细胞外基质分泌。
3.设计并建立了一套新型动态载荷与循环灌流生物反应器,每套系统共有12个循环灌流通道,可与同时连接12个灌注培养舱,每个循环灌流通道可提供的循环灌流量为0.17～20mL/min,流量恒定。连续运转5d培养液中无菌生长；加载装置能按上位计算机操作界面设定的各种频率、位移和持续工作时间等工作指令运行,实际工作频率和工作时间均和给定指令相一致,加载棒所产生的实际位移大小与所预设的位移大小值偏差在0.2‰～1.2‰范围内。
4.体外构建的组织工程骨在动态载荷与循环灌流生物反应器中培养5d和10d时,CCK-8检测结果显示:灌流培养+应变加载组的OD值均明显高于静态培养组和灌流培养组,灌流培养组则高于静态培养组。LSD-t法两两比较:P<0.05,各组间差异均有统计学意义。培养后10d,各组细胞的ALP活性(U/gprot,n=15)分别为:8.936±0.589(灌流培养+应变加载组)、7.759±0.466(灌流培养组)、5.673±0.427(静态培养组)。灌注培养组和灌流培养+应变加载组的细胞ALP活性明显高于静态培养组,尤其是灌流培养+应变加载组,成骨细胞表达更高的ALP活性。实验数据经重复测量方差分析,LSD-t法两两比较,P<0.05,均有统计学意义。各组支架切片及扫描电境观察均可看到其支架孔内和在孔壁上有成骨细胞附着生长,细胞为多角形或梭形,长出的伪足使其相互连接。灌流组及灌流加载组支架内部的细胞密度相对较高,孔内细胞呈现复层生长的情况较为多见,尤其是灌流加载组更为明显,细胞的生长数量和细胞外基质的分泌量均较多,部分孔内细胞和分泌的基质融合成片。但各组支架内部的细胞分布均有一定的“空化”现象,其中以静态培养组支架中层深部的“空化”现象较为严重,部分孔内未见到细胞生长。RT-PCR检测结果表明:单次动态应变加载完成12h后,其成骨细胞标志基因mRNA(Col I,OPN和OCN)的表达水平明显高于对照组(未加载组)；用Western-blot法测定加载完成12h后的成骨细胞标志基因蛋白的表达水平亦与此相似。
结论:
1.所制备的胶原多糖基纳米HA仿生骨支架材料,无论从组分和结构上均与天然松质骨类似,与成骨细胞相容性好,可望成为较理想的骨组织工程支架材料。
2.所研制该生物反应器可为组织培养物提供不同大小、频率的压应变以及不同速度流量的灌流条件,可控精度高、操作简单可行、性能稳定。系统密闭及无菌性能良好,提供的培育条件可满足组织工程骨长期培育的要求,是目前三维条件下研究骨细胞生物力学效应的一种较理想的动态培养与应变加载装置。
3.在动态载荷与循环灌流生物反应器中培养的组织工程骨,能明显促进MC3T3-E1成骨前体细胞在支架上的增殖和提高其成骨活性。该三维灌流和动态压应变等多种力学耦联作用下的培养方法,可望成为提高组织工程骨培育质量的一种良好模式,并成为体外三维条件下进行细胞力学生物学研究的良好平台。
胶原多糖基复合材料;纳米羟基磷灰石;骨组织工程;骨支架材料;交联生物反应器;动态培养;细胞相容性
南方医科大学
博士
生物医学工程
张西正
2011
中文
R318.17;R318.08
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2011-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）