非小细胞肺癌转移相关基因E-cadherin和microRNAs的研究
转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一,据统计,90％的癌症病人死于肿瘤细胞的转移。目前,我国肺癌的患病率持续增高,术后局部复发和远处转移是导致肺癌患者死亡的主要原因。作为肿瘤侵袭抑制因子的细胞间粘附因子E-cadherin(E-cad),其表达水平与肺癌的分化、侵袭和转移之间存在密切的联系。众所周知,CpG岛的高度甲基化是抑癌基因失活的主要机制之一。E-cad基因的高度甲基化与其表达缺陷的相关性,及其在原发性非小细胞肺癌发生发展中的重要性尚无很好的证据。E-cad基因启动子区还存在一个单核苷酸多态-160C/A,它可以降低基因的转录活性,进而提高表皮性癌的易感性,但对不同癌症患病风险的影响之间存在争议。此外,microRNAs(miRNAs)作为一类基因表达调控因子,在人类基因组中具有类似抑癌基因和原癌基因的作用,在肿瘤发生发展中起着尤为重要的作用,但有关肺癌细胞转移相关miRNAs的研究还比较缺乏。
目前,遗传学、表观遗传学和分子流行病组合而成的一种新方法——整合肿瘤学,将为我们理解肺癌发生提供新的认识,为肺癌早期诊断和转移机制提供新的证据。本论文对E-cad基因高度甲基化与缺陷表达,以及E-cad单核苷酸多态.160C/A与癌症患病风险的相关性进行了系统的分析,还通过体外侵袭模型筛选并得到转移能力差异显著的成对细胞株,并检测了肿瘤转移相关miRNAs的表达水平。整个研究分为3个部分。
第一章,基于95对非小细胞肺癌组织样本和相应的非癌组织样本,首先采用PCR-SSCP和PCR-RFLP的方法检测了E-cad基因的序列变化,结果发现E-cad-160C/A位点的变异等位基因A可以显著提高肺癌的患病风险(OR=2.81；95％置信区间,1.36-5.86)。通过甲基化特异性PCR的方法分析了E-cad基因的甲基化状况,我们发现癌组织中E-cad的甲基化比例显著增高(P＜10-5)。然后,采用RT-PCR和免疫组化的方法分析了基因mRNA和蛋白水平的表达状况,表明E-cad的表达受到了转录水平的调控,而且高度甲基化密切相关的E-cad缺陷表达是肿瘤组织的典型分子特征之一。与此同时,甲基化状态的改变在低分化癌组织中的发生频率高于分化程度较好的组织样本。最后,为了考察高度甲基化与E-cad表达缺陷之间的关系,我们在细胞系中开展了去甲基化实验,结果发现甲基化细胞系中E-cad的表达缺陷经5-Aza-dC处理后得以明显修复,进一步证实了二者之间的因果作用。
第二章,基于2006年11月份之前所报道的26篇有关E-cad基因多态-160C/A与癌症患病风险的病例.对照研究,包括7042个病例和7011个对照样本,我们采用随机效应模型计算合并后的优势比和95％置信区间,还进行了发表偏差,敏感性分析和亚组分析。Meta-分析发现,变异等位基因-160A的携带者比非携带者具有相对较高的癌症患病风险(17-19％)。不同癌症类型的亚组分析发现,纯合子-160AA对膀胱癌以及-160A携带者对肺癌和前列腺癌的患病风险都有显著地提高：还发现欧洲人群中-160A携带者的胃癌患病率显著增高,亚洲人群中携带有-160A的个体对胃癌则有一定的耐受性。尚无证据表明-160A等位基因的携带者更易于患乳腺癌、结肠癌和食道癌。
第三章,基于具有相同遗传背景和不同侵袭能力的大细胞肺癌细胞95C和95D,我们采用体外Transwell侵袭小室的模型筛选到低侵袭性细胞CLs和高侵袭性细胞DHs。经过相应的体内/体外实验分析,我们发现细胞CL3和DH3之间的侵袭/转移能力差异显著。然后,采用定量PCR的方法检测了上述系列细胞株中肿瘤转移相关miRNAs的表达水平,结果发现miR-10b具有促发肺癌细胞转移的潜能,miR-126,miR-200c和miR-335则极有可能会抑制肺癌细胞的转移。此外,miR-126和miR-200c的表达水平随着细胞侵袭能力的增强而下降,miR-200c与细胞间粘附因子E-cad的表达水平之间存在相同的趋势,暗示miR-200c可能负调控E-cad的转录抑制因子。
综上所述,本论文发现E-cad基因的高度甲基化与其表达缺陷和肿瘤分化程度显著相关,去甲基化实验为基于修复E-cad表达来扭转肿瘤状态的研究指明了方向；E-cad基因的变异等位基因-160A对膀胱癌、肺癌、前列腺癌和胃癌的发生是一个低外显率的肿瘤易感基因：获得侵袭/转移能力差异显著的细胞CL3和DH3,miR-126和miR-200c的表达水平随着细胞侵袭能力的增强而下降,miR-200c可能负调控E-cad的转录抑制因子。
非小细胞肺癌;E-cadherin细胞间粘附因子;microRNAs基因表达;调控因子;整合肿瘤学;甲基化特异性PCR法;高度甲基化
复旦大学
博士
遗传学
罗泽伟
2009
中文
R734.2;R730.23
129
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）