聚乙二醇化羟基喜树碱转铁蛋白修饰隐形纳米载药系统的肿瘤靶向研究
恶性肿瘤已经成为威胁人类健康和生命的最主要疾病之一，其发病率逐年递增，发病率和死亡率在各种疾病中均位居第二。尽管人类在过去的几十年对肿瘤生理进行了深入的探索，促进了肿瘤诊断和治疗的发展，但是多数抗肿瘤药物由于自身理化性质缺陷，无法有效富集于肿瘤以及强毒副作用，使其临床应用受到很大的限制。靶向肿瘤纳米给药系统的发展为癌症的诊断和治疗开启了一扇新的大门。其中，药物聚合物纳米载体系统由于其良好的可调控性、易于表面修饰、较高的药物包封率、较强的药物保护作用、释药机理的可控性和适于大规模生产，已成为研究热点之一。
本课题通过药剂学、高分子材料学、药理学、分子生物学等手段的交叉应用，以羟基喜树碱(HCPT)为模型药物，转铁蛋白(Tf)为靶向头基，首先制备载HCPT的主动靶向隐形纳米载药系统，将聚乙二醇(PEG)修饰的隐形化效果与Tf修饰的主动靶向作用相结合，有效递送药物到达肿瘤部位。为了进一步降低药物的毒副作用、提高和延长药效，本课题继而将HCPT聚乙二醇化制成分子共轭物(PEG-HCPT)，包载入转铁蛋白修饰主动靶向纳米载药系统，探讨其进入肿瘤细胞后，持续释放药物，结合PEG化纳米载药系统的被动靶向和Tf受体介导的主动靶向作用，进一步提高抗肿瘤药效的可能性。
第一章以叔丁氧羰基保护氨基聚乙二醇(t-Boc-NH-PEG5000-OH)为原料制备功能性材料氨基聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(NH2-PEG-PHDCA)，同法合成对照材料甲氧基聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(MePEG-PHDCA)和聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PHDCA)。采用1H-NMR，13C-NMR和FT-IR法确证各聚合物的结构。GPC法测得的分子量与理论值接近，聚合物多分散性指数均小于1.4，符合后续实验的要求。DSC法测定熔融温度和熔融焓。
第二章以NH2-PEG-PHDCA为表面修饰材料，共价连接氧化的Tf，采用薄膜水化-超声分散法制备载HCPT主动靶向隐形纳米泡囊(Tf-PEG-NS)，以粒径、表面连接Tf的个数和蛋白连接效率为指标，筛选并确定优化制备条件为Tf：PEG=1:2，反应时间12h。制得的Tf-PEG-NS粒径为(115.4±9.1)nm，Zeta电位为(3.76±0.03)mV，包封率为(93.00±0.38)％，载药量为(2.74±0.01)％，PEG链表面密度为0.45个PEG/nm2，平均每个泡囊表面连接有59个Tf，在磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中具有一定的缓释作用，60h释放达90％。
与市售注射剂、普通泡囊(non-NS)和PEG修饰泡囊(PEG-NS)相比，Tf-PEG-NS对KB、K562、S180三种肿瘤细胞毒性最强。KB细胞对Tf-PEG-NS的摄取呈现浓度与时间依赖性，且在低温条件或者过量Tf的存在下，摄取受到抑制，表明Tf-PEG-NS的摄取是能量依赖、转铁蛋白受体介导的主动转运过程。体外亚细胞器(包括细胞质和细胞核)药物经时分布实验结果表明：Tf-PEG-NS细胞核内摄取量最高，孵育12h时，Tf-PEG-NS的核内相对摄取量分别为注射剂、non-NS和PEG-S的79、5.9和1.7倍。载药泡囊倾向于分布于细胞核内，而HCPT更倾向于分布于细胞浆，且维持在低浓度水平。
进一步考察三种泡囊在SD大鼠的体内药动学行为，结果显示PEG修饰隐形纳米泡囊能显著延长药物滞留于血液循环的时间。Tf-PEG-NS与PEG-NS分别将HCPT的t1/2β由0.91 h延长至10.39h和11.32 h，AUC分别为non-NS的3.91、4.30倍，为注射剂的7.49、8.23倍，但两者的t1/2β、AUC、MRT无显著性差异。S180荷瘤小鼠组织分布和抗肿瘤作用实验结果表明：Tf-PEG-NS肿瘤峰浓度最高(分别为HCPT注射液、non-NS和PEG-NS的4.00，2.83和1.51倍)、肿瘤蓄积量最大(分别为HCPT注射液、non-NS和PEG-NS的16.97，3.32和1.45倍)、抗肿瘤活性最强(抑瘤率分别为HCPT注射液、non-NS和PEG-NS的2.40，2.00和1.55倍)，充分显示了被动靶向和主动靶向结合的优越性。
第三章以MePEG2000-COOH为酰化试剂，选择性酯化HCPT的10-OH合成PEG-HCPT共轭物。产物以TLC、1H-NMR和FT-IR表征，确证结构。采用强酸水解-HPLC分析法测得产物的纯度>98％。MALDI-TOF质谱仪测得产物的绝对分子量为2500.56，确证1分子MePEG-COOH与1分子HCPT反应。药物PEG化后，水溶性显著增强，化合物在酸性条件下稳定，于肿瘤细胞长期暴露(72h)，毒性与原药相当，为下一步制备载药系统提供物理、化学和生物学依据。
第四章采用复孚L/溶媒蒸发法制备载PEG-HCPT共轭物的转铁蛋白修饰隐形纳米粒。制得的PEG-HCPT/Tf-PEG-NP粒径为(109.8±5.3)nm，包封率为(56.63±1.02)％，载药量以HCPT计为(2.73±0.03)％，平均每个纳米粒表面连接有59个Tf。Tf-PEG-NP的Zeta电位为(-11.79±0.18)mV，低于Tf-PEG-NS；其PEG链表面密度显著高于Tf-PEG-NS。在PBS(pH7.4)中缓释作用明显，72h释放小于60％。
PEG-HCPT/Tf-PEG-NP孵育24h的细胞毒性低于HCPT/Tf-PEG-NS；孵育时间延长至48h时，两者的细胞毒性相当。PEG-HCPT/Tf-PEG-NP在细胞浆和细胞核中药物浓度持续缓慢增加，孵育48h时细胞核内药物相对摄取量显著高于其他系统，分别为HCPT/Tf-PEG-NS、PEG-HCPT/PEG-NP和PEG-HCPT/non-NP的1.61、1.38和3.72倍。而HCPT/Tf-PEG-NS的细胞浆和细胞核内药物浓度均在12h达峰后下降。深入探讨载体系统的细胞摄取和转运机制。结果表明转铁蛋白修饰的纳米载体系统可通过网格蛋白有被小窝和细胞膜穴样凹陷依赖性内吞途径为KB细胞所摄取，后经溶酶体途径和高尔基体的运输，实现细胞内转运。
无论是大鼠血浆药动学、荷瘤小鼠肿瘤靶向性评价，还是抗肿瘤活性实验，PEG-HCPT/Tf-PEG-NP均表现出卓越的载药系统特性。表面高PEG链密度赋予其显著延长的血液循环时间(t1/2β长达20.92h)，有利于增强EPR效应被动富集于肿瘤部位。PEG-HCPT/Tf-PEG-NP与PEG-HCPT/PEG-NP的药动学参数无显著性差异，但是Tf修饰的主动靶向作用使PEG-HCPT/Tf-PEG-NP在肿瘤部位的峰浓度最高，为PEG-HCPT/PEG-NP的1.66倍；蓄积量最大，为PEG-HCPT/PEG-NP的2.12倍；te值最大，表明其对肿瘤组织的选择性最强。由于载PEG-HCPT共轭物纳米粒的缓慢释药，使PEG-HCPT/Tf-PEG-NP在给药24h时的药物浓度为HCPT/Tf-PEG-NS的2.51倍。PEG修饰的隐形化效果、Tf修饰的主动靶向作用和纳米粒包裹PEG化药物持续释药三个方面共同作用的结果使PEG-HCPT/Tf-PEG-NP具有最强的抗肿瘤效果，抑瘤率达93.43％，分别为HCPT/Tf-PEG-NS的1.23倍，PEG-HCPT/PEG-NP的1.25倍，PEG-HCPT/non-NP的1.53倍，PEG-HCPT的1.85倍，HCPT的2.79倍。实验结果基本达到实验设计的预定效果。
转铁蛋白;聚乙二醇;羟基喜树碱;非离子表面活性剂泡囊;纳米载药系统;肿瘤靶向治疗
复旦大学
博士
药剂学
裴元英
2009
中文
TQ423.21;R944.9
203
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）