深海洋中脊沉积物砷抗性菌的多样性分析
自然界中的微生物在砷的生物地球化学循环中起着重要作用。海洋砷的主要来源是岩浆活动,深海热液口活动是砷的一个重要来源。微生物通过累积、甲基化、氧化、还原等作用参与砷价态改变和元素循环,但是目前关于海洋环境的砷抗性菌知之甚少,尤其是深海环境。为了解深海环境中的微生物主要的砷抗性细菌,本论文对印度洋、大西洋中脊深海沉积物砷抗性菌的多样性进行研究。
本文用含有2 mmol/L NaAsO2的PTA培养基富集来自印度洋和大西洋七个不同站点的深海沉积物样品,得到七个砷抗性菌群。我们对这些菌群的砷抗性菌进行了筛选,同时构建16SrDNA文库与DGGE相结合的方法对其中三个菌群(站点IR-TVG1、IRTVG2、IR-TVG3)的结构进行了解析；分析了不同培养时间和不同砷浓度下IR-TVG2、IR-TVG3站点的抗性菌群结构的变化。
从七个砷抗性菌群中共分离到102株单菌,分属于28个属50个种,主要为变形菌纲α和γ亚群与Actinobacteria(放线菌门,高G+C革兰氏阳性菌)类群。微杆菌、食烷菌、海杆菌、Idiomarina、盐单胞菌和假交替单胞菌占优势,其中1株菌可能属于新属新种,15株菌可能属于新种。
通过构建16SrDNA文库与DGGE结合的方法,确定站点IR-TVG1抗性菌群中的优势抗性菌为假交替单胞菌;站点IR-TVG2抗性菌群中的优势抗性菌为食烷菌与微杆菌；站点IR-TVG3抗性菌群中的优势抗性菌为微杆菌。从IR-TVG2、IR-TVG3分离到的微杆菌虽然16S rRNA序列完全一样,但它们的重复PCR指纹图谱和砷抗性能力不一样。
为了了解取样时间和砷浓度对菌群结构的影响,我们选取IR-TVG2、IR-TVG3站点的抗性菌群做进一步的DGGE分析。结果显示,不同取样时间和不同砷浓度下两站点的抗性菌群结构变化明显。在2mM富集培养条件下,IR-TVG2在培养的初期只有一优势条带,但28h后出现另一条优势条带；但在20mM富集培养条件下没有随时间发生变化。IR-TVG3在两种浓度的富集培养条件下,菌群结构一直没有变化。在0-60mM的砷浓度下,IR-TVG2样品的优势条带随着砷浓度的提高而变少,而IR-TVG3样品,在低浓度砷富集培养条件下仅一条优势条带,但随着砷浓度的提高而出现了第2条优势条带。
对筛选到的102株单菌进行了砷抗性范围测定,可在10mM NaAsO2存在下正常生长的菌株仅占总菌数的16.6％,这些高抗性的单菌主要筛选自IR-TVG2和IR-TVG3。这可能是这两站点混合菌群比其他菌群抗性高的因为。这些具有高抗性的菌株主要属于Microbacterium属,占52.6％；但实验结果表明,菌株抗性与种属没有必然联系,同属甚至同种的细菌有时表现出差异极大的抗性能力。此外不同的培养基培养条件,相同的菌株也会表现出差异的抗性能力。
利用兼并引物扩增砷流出泵基因(arsB与ACR3),共获得17个目的大小的基因片段,测序比对结果显示,这些基因与已报道的砷流出泵基因相似度在75％左右。实验结果表明,单菌是否具有砷流出泵与其种属和抗性能力没有必然联系。在获得的优势菌中,均未扩的砷流出泵基因,说明它们存在其他的砷抗性机制。
对从热液口虾的头部富集分离到的单菌D8—2(Brachybacterium paraconglomeratum,100％)进行初步的研究,结果显示该菌具有良好的砷抗性能力,但不具有砷氧化能力,D8—2对砷具有很好的胞内累积作用,累积量达到2313.7μg As g-1细胞干重,为目前的细菌砷累积量之最高。
对来自站点IR—TVG1的单菌CK—I1-6(Pseudomonas alcalophila,99.9％)进行初步的研究,扩增得到-750bp大小的基因片段,该基因与Pseudomonas sp.AO7的砷流出泵ACR3基因相似性76％。该菌有良好砷抗性,但不具有砷氧化能力,其抗性机制可能与砷流出泵相关。
深海环境;砷抗性菌群;生物多样性;中脊沉积物砷
国家海洋局第三海洋研究所
硕士
海洋生物学
邵宗泽
2008
中文
Q178.533
89
2011-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）