金属硫蛋白对皮瓣缺血再灌注损伤时相关凋亡基因Caspase-3表达影响的实验研究
目的：在建立大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤模型的基础上，采用半定量反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction， RT-PCR)、免疫组织化学法，并应用外源性葡萄糖酸锌诱导体内MT生成，观察大鼠皮瓣缺血再灌注组织中不同时间点细胞凋亡及Caspase-3基因和蛋白的表达，探讨MT对缺血再灌注损伤相关基因Caspase-3表达的影响，从基因水平阐明MT对缺血再灌注损伤皮瓣的保护作用机理，对为防治各种组织瓣移植中出现的缺血再灌注损伤，提高组织瓣移植成活率的临床研究，提供新的思路和理论依据。
方法：
1.实验动物：雄性健康清洁级Wistar大鼠120只，称重，编号。
2.实验动物分组：把120只大鼠随机分为三组：(1)实验A组（缺血再灌注组）(2)实验B组（给药组）(3)对照组，每组40只，各组按5个时间点再分为5组，每组8只大鼠。
3.皮瓣制备方法：2％戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，每3小时追加一次(20mg/kg)以维持麻醉，大鼠仰卧，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照Petry JJ等描述的方法，于右下腹设计一以腹壁浅血管为蒂的轴形皮瓣，大小为6cm×3cm。对照组在皮瓣形成后原位缝合，不做其他处理；实验A组在皮瓣形成后，用微血管夹夹闭腹壁浅动脉发出点近端的股动脉，在手术显微镜下确认股动脉和腹壁浅动脉被完全阻断，皮瓣原位缝合，8小时后再次手术去除血管夹；实验B组于术前24小时，向大鼠管饲葡萄糖酸锌140mg/Kg，其余操作同实验A组。
4.取材：实验A组和B组的40只大鼠于掀起皮瓣后即刻、再灌注后1小时、6小时、12小时和24小时分别于皮瓣中段边缘取全层皮瓣组织1cm×0.5cm，对照组分别于掀起皮瓣即刻、术后9小时、14小时、20小时和32小时取材。所取组织一半用4％多聚甲醛固定，行免疫组化检测；另一半超低温冰冻保存，制作单细胞悬液，以备Caspase-3 mRNA检测。
5.检测方法及指标：(1) HE染色切片，光镜下进行组织病理学观察。细胞核呈蓝色，胞浆呈粉红色，肌纤维及胶原纤维呈红色。(2)免疫组化检测及评分：对石蜡切片进行SP法免疫组化染色，步骤严格按照试剂盒说明书进行，光镜下观察Caspase-3蛋白的分布和着色深浅程度，阳性与阴性对照同时进行，阳性信号以胞质或胞膜有棕黄色或棕褐色颗粒为判定标准。免疫组化评分(immunohistochemical scores，IHS)方法参照文献，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分：a为阳性细胞百分比(无阳性细胞=0，阳性细胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b为阳性细胞染色强弱（阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强阳性=3），a，b两项乘积即为该例组织的IHS。(3)逆转录，多聚酶链反应法（reverse transcription，RT-PCR）半定量检测Caspase-3 mRNA水平：根据文献报道设计引物序列，由北京塞百盛基因技术有限公司合成。引物序列：Caspase-3上游引物：5｀- AAGCCGAAACTCTTCATC-3｀，Caspase-3下游引物：5｀- TGAGCATTGACACAATACAC-3｀。β-actin上游引物：5｀- TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG-3｀，β-actin下游引物：5｀- GGAACCGCTCATTGCCGATAGT-3｀。按Trizol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，RNA保存在-80℃，用紫外分光光度吸收法测定RNA的含量。然后进行逆转录和PCR扩增反应，取每个标本的扩增产物于琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker(DL2000)作为标准片段标记，电泳后以紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机应用凝胶图象分析系统对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。
6.统计学处理：用SPSS13.0统计学处理软件，对不同类型数据进行不同的统计学处理。
结果：
1.皮瓣缺血再灌注时的组织病理学变化：缺血再灌注后，实验A组可见大多数细胞胞体缩小，核固缩，胞质嗜酸性深染，这种变化在再灌注后24小时尤为明显。对照组的组织形态学结构基本正常，无上述变化。而实验B组异常细胞均较实验A组显著减少，且受损程度较轻，多表现为细胞胞浆轻度深染，核固缩，仁消失者也少见。
2.免疫组化染色结果：染色主要位于胞浆，呈棕黄色或棕褐色。光镜下观察，Caspase-3阳性细胞主要在皮瓣组织的上皮基底细胞层、成纤维细胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管内皮细胞中，和凋亡细胞的分布区域基本相同。对照组可见少量、散在分布的Caspase-3阳性细胞，面积小，染色浅，表达微弱；实验A组Caspase-3阳性细胞表达随缺血再灌注时间延长呈逐渐增强趋势，并在缺血再灌注24小时后达高峰。可见连成线片状，染色最深，表达最强；而实验B组则较A组表达明显减弱。正常对照组与实验A组和实验B组表达比较差异有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化染色评分：结果显示，实验A组的阳性细胞表达随时间增长逐级增强，与对照组相比有显著差异(P＜0.01)，再灌注后24小时达高峰。实验B组虽然也逐渐增强，但是相邻时间点之间并无显著差异(P＞0，05)。但实验 A组和实验B组之间阳性细胞表达差异明显(P＜0.01)，说明应用葡萄糖酸锌后产生的金属硫蛋白对Caspase-3活性表达有一定抑制作用。
3.RT-PCR法测Caspase-3 mRNA水平：根据PCR-Marker所示，RT-PCR结果显示所扩增的Caspase-3基因片段大小约为349 bp，内参B-Actin基因片段大小约576 bp，与目标片段大小一致，提示均为特异性扩增。对照组 Caspase-3 mRNA有少量表达。实验A组在掀起皮瓣即刻、缺血再灌注1 h和再灌流6h后，Caspase-3 mRNA表达明显增加，以后随着再灌注时间的延长，表达逐渐增强，至再灌注24h达高峰，以后增幅逐级减小(相邻时间点比较P＜0.05)。在实验B组中，随再灌注时间的延长，Caspase-3 mRNA表达活性虽然也在增加，但是与实验A组相比其增幅显著降低(P＜0.05)。
结论：
1.皮瓣缺血再灌注后，其组织内出现Caspase-3活性增高，提示 Caspase-3参与了皮瓣组织缺血再灌注时细胞凋亡的调控过程。
2.应用葡萄糖酸锌后，皮瓣缺血再灌注后Caspase-3的表达活性有所下降，进一步证实Caspase-3确实参与了皮瓣组织细胞凋亡过程且可通过抑制Caspase-3活性而改善缺血再灌注损伤。
3.锌制剂可以诱导金属硫蛋白产生，而金属硫蛋白可能通过调控 Caspase-3的表达，降低其活性，来实现对皮瓣缺血再灌注损伤的保护作用。
缺血再灌注损伤;皮瓣;移植成活率;细胞凋亡;Caspase-3表达;金属硫蛋白;葡萄糖酸锌;聚合酶链反应
河北医科大学
硕士
外科学
仇树林
2011
中文
R622.1;R363.1
53
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）