RASSF1A基因在子宫内膜癌中甲基化状态及表达
子宫内膜癌是最常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一，在发达国家，发病率居女性生殖道恶性肿瘤首位，死亡率居第二位，高发年龄为50～61岁。近年来，由于环境、生活方式等因素的共同影响，子宫内膜癌发病呈现年轻化趋势。目前，子宫内膜癌的发病机制仍不十分清楚，大家广泛认可的相关因素有：长期持续的雌激素刺激，患者自身体质原因如肥胖、糖尿病、高血压、不孕或绝经延迟，遗传因素。子宫内膜癌的发生是一个复杂的、伴随许多分子生物学改变的多因素共同作用的结果。随着人类基因组测序工程的顺利完成，近年来从分子层面研究子宫内膜癌基因改变成为研究的热点。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，将甲基基团转移到胞嘧啶环的第5位碳原子上，是目前己知的哺乳动物唯一的自然化学修饰方式，其本质是在不改变DNA碱基序列的前提下，对DNA进行化学修饰，从而影响基因下游产物表达，最终导致肿瘤的发生。DNA甲基化多发生在CpG岛位点，CpG岛是长度＞200bp，C+G的含量≥50％的DNA序列，多位于基因的启动子区域。正常细胞的CpG岛处于非甲基化状态，当抑癌基因启动子区CpG岛发生甲基化时，导致基因表达沉默，抑癌功能丧失。越来越多的研究证明，肿瘤组织中存在抑癌基因的高甲基化状态及表达产物减少或缺失，DNA启动子甲基化是肿瘤发生、发展的重要机制之一。
Ras相关区域家族1A基因(Ras associated domain family1A，RASSF1A)是2000年发现的一种新型抑癌基因，其cDNA编码产物是分子量为38800的蛋白多肽，RASSF1A蛋白在正常组织中100％表达，参与细胞周期调控，通过多种途径抑制细胞的过度生长、分化，促进细胞衰老、凋亡。当发生基因启动子甲基化时，可能使编码产物RASSF1A蛋白表达减少或缺失，抑制细胞过度增殖的作用消失，最终导致肿瘤发生。
目的：关于RASSF1A基因甲基化与子宫内膜癌关系的研究在国内鲜有报道，本文旨在通过MSP法检测子宫内膜癌中RASSF1A基因启动子区甲基化状态及RASSF1A蛋白表达情况，揭示RASSF1A基因甲基化与子宫内膜癌的发生、发展的关系。
方法：收集2008—2010年河北医科大学第三医院、第四医院手术切除经病理证实的子宫内膜癌标本40例（患者术前均未行放、化疗），同时选取行全子宫切除正常增生期子宫内膜40例（患者术前无异常子宫出血，半年内未行激素治疗）。新鲜标本取出后立即置入-80℃冰箱保存，以备提取组织DNA，同时取部分新鲜组织标本经10％中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 u m连续切片，供免疫组织化学试验所用。
应用甲基化特异性PCR(MSP)检测RASSF1A基因启动子甲基化状态，MSP的基本原理：模板DNA经NAOH变性形成单链，经亚硫酸氢钠修饰后，甲基化的DNA胞嘧啶保持不变，未甲基化的DNA胞嘧啶转化成尿嘧啶，利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠脱氨基变成尿嘧啶的原理，设计甲基化与非甲基引物，进行PCR扩增，以此检测甲基化状态。通过检测子宫内膜癌与正常子宫内膜中RASSF1A基因启动子区甲基化状态，比较两组之间甲基化率的差异。
采用免疫组织化学方法检测子宫内膜癌及正常子宫内膜RASSF1A蛋白表达情况：甲醛溶液固定的内膜组织经过洗涤脱水和石蜡包埋，4μm连续切片。RASSF1A蛋白免疫组化染色后表达在细胞浆，为棕黄色颗粒，呈弥漫性分布，尤以腺体处表达最为明显。阳性表达判定标准：在高倍镜视野下(×400)，随机选取5个视野，每个视野细胞数不少于100，分别计算阳性细胞百分比及细胞染色强度，并予以评分：
评分阳性细胞数染色深度
O分＜5％无色；
1分5～25％淡黄色；
2分26～50％黄色；
3分51～75％棕褐色；
4分＞75％RASSF1A蛋白阳性表达=阳性细胞百分比×染色深度：
O～2分阴性（-）
3～8分阳性(+)
9～12分强阳性(++)
结果：
1.RASSF1A基因甲基化状态：40例子宫内膜癌中，27例癌组织存在RASSF1A基因启动子甲基化，甲基化频率67.5％(27/40);40例正常子宫内膜，5例组织存在RASSF1A基因启动子甲基化，甲基化频率12.5％(5/40)。子宫内膜癌RASSF1A基因启动子甲基化率明显高于正常子宫内膜，两组比较差异有统计学意义（x2=25.208，P=O．000＜0.01）。
2.RASSF1A蛋白表达情况：40例子宫内膜癌中，17例RASSF1A蛋白表达阳性，表达率42.5％(17/40);40例正常子宫内膜RASSF1A蛋白阳性表达100％(40/40)。子宫内膜癌中RASSF1A蛋白阳性表达率明显低于正常子宫内膜，差异有统计学意义(x2=32.281，P=O．000＜0.01)。
结论：子宫内膜癌组织中，存在RASSF1A基因高甲基化及RASSF1A蛋白显著低表达或缺失，由此可以推断：
1.RASSF1A基因启动子甲基化可能造成该基因失活的原因，表达产物减少或缺失与基因甲基化密切相关。
2.RASSF1A基因启动子甲基化可能是子宫内膜癌的发病机制之一，RASSF1A蛋白表达减少或缺失对子宫内膜癌的发生、发展起了重要作用。
3.RASSF1A有望成为子宫内膜癌的分子标志物，从而为子宫内膜癌的早期诊断及生物靶向治疗提供理论依据。
DNA甲基化;子宫内膜癌;RASSF1A;基因表达;CpG岛;发病机制
河北医科大学
硕士
妇产科学
杜建层
2011
中文
R737.33;R730.2
45
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）