厄洛替尼联合放射诱导人胃肿瘤MKN45细胞株凋亡效应的实验研究
目的：观察厄洛替尼联合放疗对MKN45细胞的增殖抑制作用以及对细胞周期和凋亡的影响，了解厄洛替尼对放疗的增敏作用。
方法：
1.MKN45细胞在37°、5％的CO2孵箱于含10％胎牛血清和1％双抗（青霉素和链霉素）的DMEM培养基中，24小时后取对数生长期细胞用于实验。
2.甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测.(1)不同浓度的厄洛替尼作用于MKN45细胞后24、48、72、96小时后的细胞生长情况。(2)不同剂量照射MKN45细胞后72小时的细胞生长抑制率。(3)不同浓度厄洛替尼联合放射线对MKN45细胞的生长抑制率。本研究所有实验重复3次。
3.倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。
4.单细胞集落形成实验观察对照组、单纯照射组、厄洛替尼单药组、厄洛替尼＋照射组的克隆数。
5.多靶单击模型S=1-(1-e-D/D0)N，拟合存活曲线并计算D0、Dq值，计算放射增敏比。
6.流式细胞仪检测MKN45细胞经厄洛替尼及厄洛替尼联合照射处理后细胞周期分布情况。
7.流式细胞仪(FCM)检测Annexin V-EGFP和PI染色的MKN45细胞的凋亡率。
8.Western Blots法检测MKN45细胞经厄洛替尼及厄洛替尼联合照射处理后Bax与Bcl-2的表达。
9.统计分析所有计量资料的数据均以x士s表示，实验数据采用SPSS11.5统计软件处理。均数比较采用单因素方差分析、LSD-t检验，相关分析采用析因设计方差分析，与对照组比较，P＜0.05为有统计学意义。
结果：
1.厄洛替尼对MKN45细胞的作用（MTT法）
厄洛替尼能明显抑制MKN45细胞的生长，随用药时间的延长，抑制率明显上升(P＜0.05)；随用药浓度的提高，抑制率逐渐升高(P＜0.05)。MKN45细胞的存活分数SF值随厄洛替尼药物浓度的增加或作用时间的延长而减少(P＜0.001)。
2.放射线及厄洛替尼对MKN45细胞的作用(MTT法)给予2、4、6、8Gy的剂量照射后72小时，MKN45细胞的生长明显受到抑制，并且随着照射剂量的增大，抑制率也有增大的趋势。当厄洛替尼浓度为2.5、5、10、15μmol/L时，与放射线联合的抑制作用大于单药或单独照射的作用，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.厄洛替尼作用后细胞形态变化厄洛替尼及与放射联合作用于MKN45细胞24小时后即有部分细胞皱缩，随着药物浓度的增大和时间的延长，细胞表面可见突起小膜泡（凋亡小体）不断地脱落于培养液中；48小时后细胞变小变圆，皱缩变形的细胞进一步增多，细胞数目减少；72小时后细胞数目显著减少，部分细胞胞膜破裂呈坏死状，胞浆浓缩呈泡状，核仁消失。
4.厄洛替尼联合放射线对MKN45细胞的作用（单细胞集落形成实验）
厄洛替尼(2μmol/L)+照射组(6Gy)及单纯照射(6Gy)组单细胞集落形成率分别是(1.97士0.14)％、(5.1士0.21)％，两者有显著差异(P＜0.05)，提示厄洛替尼联合放疗能明显抑制MKN45细胞的克隆性增殖。应用多靶单击模型求得，经厄洛替尼处理后D0值减低，Dq值变小，放射增敏比为1.54。提示厄洛替尼对MKN45细胞有放射增敏作用。
5.厄洛替尼对细胞周期的影响经厄洛替尼作用后，MKN45细胞周期中的G1/G0期比例明显增多，随着时间的延长S期比例减少，24、48小时各时间段之间的差异有统计学意义(P＜0.01)，说明厄洛替尼可使MKN45细胞相对放射敏感期细胞增多。MKN45细胞经单纯照射后，G2/M期比例明显升高。厄洛替尼+单纯照射组照射后G2/M期比例较对照组也升高，升高的程度与单纯照射组相比较有统计学意义(P＜0.01)，厄洛替尼EGFR抑制剂的检查点(check-point)为G1期，而放射线为G2期，两者联合使用后使放射不敏感的S期肿瘤细胞的比例降低，放射较为敏感的G2/M期和G0/G1期细胞比例增加，可增加细胞对放射的敏感性。
6.厄洛替尼对细胞凋亡的影响在照射后48小时，凋亡率分别为，对照组为（4.34±0.63）％、照射组为(11.10士1.45)％、厄洛替尼组＋照射组为(23.2士0.41)％，经析因设计方差分析方法统计，各组间都有统计学意义(P＜0.05)。表明厄洛替尼联合照射后凋亡率明显增加，提示二者具有协同作用。
7.厄洛替尼对Bcl-2、Bax蛋白表达但的影响（western blots法）
根据western blots结果发现，Bax蛋白在对照组表达量较低，而Bcl-2恰恰相反，表达量较高。经过厄洛替尼及照射作用后，出现Bcl-2蛋白表达量明显减少，厄洛替尼+照射组减少最明显；Bax蛋白表达相反，厄洛替尼+照射组增加最明显。厄洛替尼可增强放射调解Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比率的作用而在分子水平上抑制肿瘤生长。
结论：厄洛替尼联合放疗对MKN45细胞有明显抑制作用。厄洛替尼的检查点(check-point)为G1期，而放射线为G2期，两者联合使用后使放射不敏感的S期肿瘤细胞的比例降低，放射较为敏感的G2/M期和GO/GI期细胞比例增加，与放射联合能增加细胞凋亡率，应用多靶单击模型求得，放射增敏比为1.54，提示厄洛替尼对MKN45细胞具有放疗增敏的作用。
厄洛替尼;放疗增敏;胃癌;MKN45细胞;细胞凋亡;Bax;Bcl-2
河北医科大学
硕士
肿瘤学
王雅棣
2011
中文
R735.2;R730.55
63
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）