血管平滑肌细胞钙化过程CaN对IP3RI的调节作用
目的:动脉钙化是老年人常见的一种异位钙化的病理现象,它与心肌梗死、脑卒中和猝死等心脑血管疾患密切相关。血管钙化既往被认为是一个被动过程,是老年化导致的血管退行性变化。近年的研究显示血管的钙沉积是类似于骨形成的主动可调节过程,包括血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs)等钙化血管细胞向成骨细胞表型转换、成骨相关基质的表达和骨样结构形成。VSMCs表型转化是高血压、动脉粥样硬化和心肌梗死等心血管疾病的共同发病基础。
哺乳动物细胞包含两个钙离子(Ca2+)胞内钙释放通道,即三磷酸肌醇受体(IP3R)和雷尼丁受体(RyR)。IP3R和RyR是多基因家族的产物。其中IP3R家族至少包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。VSMCs表达大量IP3RI,而IP3RⅡ、Ⅲ、Ⅳ型则表达很局限。细胞外配体与胞浆膜G蛋白受体或酪氨酸激酶受体结合,激活磷脂酶C(PLC)产生IP3,后者与内质网IP3R结合,产生复杂的胞浆钙浓度信号(包括瞬间振荡和钙波)。IP3介导的细胞内游离Ca2+浓度变化参与多数细胞生理过程的调节。钙调神经磷酸酶(CaN)是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,属于PP2B家族,是迄今所知的唯一受Ca2+/钙调素调节的磷蛋白磷酸酶。CaN广泛分布于脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞、血管平滑肌和心血管内皮等组织细胞中,主要表达于胞浆中,由催化亚基A和调节亚基B组成异源二聚体。CaN通过对底物去磷酸化,参与多种细胞功能调节。近年CaN在诱导心肌肥大中的作用已经被认识。目前研究己发现CaN是细胞内游离Ca2+的下游信号分子,但是在VSMCs增殖过程中,CaN能够负反馈调节细胞内游离Ca2+浓度。此外,胞内钙离子释放同时也受胞浆钙浓度正负反馈的调节,而且细胞浆游离钙浓度变化对于IP3RⅠ基因的转录有直接的调节作用,而在细胞钙化中的CaN对IP3RⅠ的调节作用目前国内外尚未见有报道。
本试验采用磷酸二氢钠建立大鼠主动脉VSMCs钙化模型,测定细胞IP3RⅠ及CaN mRNA、蛋白质的表达及活性,并观察CaN对IP3RⅠ表达的影响,初步探讨CaN及IP3RⅠ对细胞钙化的调节作用,为细胞钙化的临床防治提供新的思路。
方法:大鼠胸大动脉VSMCs传代培养后,将实验细胞随机分为3组。A组:对照组;B组:钙化组;C组:干预组(简称CsA组)。A组给予正常对照的DMEM培养基3ml,B组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的DMEM培养基3ml,C组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的DMEM培养基3ml同时加入浓度为5mg/L的免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)30ul,分别培养6天,每3天换液一次,于第6天收集细胞。茜素红染色示钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,可见大量褐色钙化点,提示细胞钙化成功。取材后每组用ELISA法测定大鼠主动脉VSMCs CaN活性、Ca2+含量,实时荧光定量反转录PCR法测定CaNB mRNA和IP3RⅠmRNA, Western blot法测定CaNB及IP3RⅠ蛋白定量,采用比色法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;所有数据以均数±标准差(-x±s)表示,运用SPSS13.0统计软件,首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,两两比较应用LSD-t检验,P<0.05即有统计学意义。
结果:
(1)茜素红染色结果示对照组大鼠主动脉VSMCs呈梭形,排列整齐,未见钙化点;钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,可见褐色钙化点;CsA组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,也可见大量褐色钙化点。
(2)实时荧光定量反转录PCR法结果显示:CsA组与对照组对比:CsA组CaNBmRNA(3.38±0.77)较对照组(1.10±0.28)表达显著增加(P<0.01);CsA组IP3RⅠmRNA(2.58±0.53)较对照组(1.02±0.15)表达显著增加(P<0.01);钙化组与对照组对比:钙化组CaNB mRNA(6.27±1.45)较对照组(1.10±0.28)表达显著增加(P<0.01);钙化组IP3RⅠ mRNA表达(5.90±1.41)较对照组(1.02±0.15)表达显著增加(P<0.01);钙化组与CsA组对比:CsA组CaNBmRNA(3.38±0.77)较钙化组(6.27±1.45)表达显著减少(P<0.01)。CsA组IP3RⅠ蛋白(2.58±0.53)较钙化组(5.90±1.41)表达显著减少(P<0.01)。
(3)Western blot法测定结果显示:CsA组与对照组对比:CsA组CaNB1蛋白(48.22±2.47)较对照组(29.9±1.39)表达显著增加(p<0.01), IP3RⅠ蛋白(1155.10±71.42)较对照组(397.87±39.94)表达也显著增加(p<0.01);钙化组与对照组对比:钙化组CaNB蛋白(69.11±2.51)较对照组(29.9±1.39)表达显著增加(p<0.01),IP3RⅠ蛋白(1865.40±128.57)较对照组(397.87±39.94)表达显著增加(p<0.01);CsA组与钙化组对比:CsA组CaNB蛋白(48.22±2.47)较钙化组(69.11±2.51)表达显著减少(p<0.01),IP3RI蛋白(1155.10±71.42)较钙化组(1865.40±128.57)表达显著减少(p<0.01)。
(4)ELISA法测定大鼠主动脉VSMCsCaN活性:钙化组(21.47±1.86IU/L)较对照组(14.31±0.24IU/L)表达显著增加(P<0.01),CsA组(15.34±0.14IU/L)较对照组(14.31±0.24IU/L)表达无显著变化(P>0.05),CsA组(15.34±0.14IU/L)较钙化组(21.47±1.86IU/L)表达显著减少(P<0.01)。
(5)ELISA法测定大鼠主动脉VSMCsCa2+含量:钙化组(9.01±0.32pg/ml)较对照组(6.03±0.33pg/ml)Ca2+浓度显著增加(P<0.01),CsA组(10.39±0.70pg/ml)较对照组(6.03±0.33pg/ml)Ca2+浓度显著增加(P<0.01),CsA组(10.39±0.70pg/ml)较钙化组(9.01±0.32pg/ml)Ca2+浓度显著增加(P<0.05)。
(6)用比色法测定细胞内ALP活性(U·g-1 protein),相对于对照组(38.74±2.23),钙化组的ALP活性(146.04±9.02)显著增高(P<0.01),但比CsA组(216.69±14.0)其ALP活性显著降低(P<0.01);CsA组(216.69±14.0)较对照组(38.74±2.23)显著增高(P<0.01)。
结论:
1.本实验采用磷酸二氢钠成功地建立了大鼠主动脉VSMCs钙化模型。
2.本试验发现钙化VSMCs中IP3RⅠ及CaN mRNA、蛋白的表达明显增加,应用CsA后IP3RⅠmRNA和蛋白的表达减低,说明在钙化细胞中CaN对IP3RⅠ有激活作用。3CsA可能促进细胞钙化。
血管平滑肌细胞;动脉钙化;心脑血管疾患;磷酸二氢钠;细胞钙化调节;钙调神经磷酸酶;三磷酸肌醇受体Ⅰ;环孢霉素A
河北医科大学
硕士
内科学
李绍冰
2011
中文
R592;R363.2
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2011-09-28(万方平台首次上网日期,不代表论文的发表时间)