血管平滑肌细胞钙化过程CaN对IP3RI的调节作用
目的：动脉钙化是老年人常见的一种异位钙化的病理现象，它与心肌梗死、脑卒中和猝死等心脑血管疾患密切相关。血管钙化既往被认为是一个被动过程，是老年化导致的血管退行性变化。近年的研究显示血管的钙沉积是类似于骨形成的主动可调节过程，包括血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)等钙化血管细胞向成骨细胞表型转换、成骨相关基质的表达和骨样结构形成。VSMCs表型转化是高血压、动脉粥样硬化和心肌梗死等心血管疾病的共同发病基础。
哺乳动物细胞包含两个钙离子(Ca2+)胞内钙释放通道，即三磷酸肌醇受体(IP3R)和雷尼丁受体(RyR)。IP3R和RyR是多基因家族的产物。其中IP3R家族至少包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。VSMCs表达大量IP3RI，而IP3RⅡ、Ⅲ、Ⅳ型则表达很局限。细胞外配体与胞浆膜G蛋白受体或酪氨酸激酶受体结合，激活磷脂酶C(PLC)产生IP3，后者与内质网IP3R结合，产生复杂的胞浆钙浓度信号（包括瞬间振荡和钙波）。IP3介导的细胞内游离Ca2+浓度变化参与多数细胞生理过程的调节。钙调神经磷酸酶(CaN)是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，属于PP2B家族，是迄今所知的唯一受Ca2+/钙调素调节的磷蛋白磷酸酶。CaN广泛分布于脑、心肌、骨骼肌、T淋巴细胞、血管平滑肌和心血管内皮等组织细胞中，主要表达于胞浆中，由催化亚基A和调节亚基B组成异源二聚体。CaN通过对底物去磷酸化，参与多种细胞功能调节。近年CaN在诱导心肌肥大中的作用已经被认识。目前研究己发现CaN是细胞内游离Ca2+的下游信号分子，但是在VSMCs增殖过程中，CaN能够负反馈调节细胞内游离Ca2+浓度。此外，胞内钙离子释放同时也受胞浆钙浓度正负反馈的调节，而且细胞浆游离钙浓度变化对于IP3RⅠ基因的转录有直接的调节作用，而在细胞钙化中的CaN对IP3RⅠ的调节作用目前国内外尚未见有报道。
本试验采用磷酸二氢钠建立大鼠主动脉VSMCs钙化模型，测定细胞IP3RⅠ及CaN mRNA、蛋白质的表达及活性，并观察CaN对IP3RⅠ表达的影响，初步探讨CaN及IP3RⅠ对细胞钙化的调节作用，为细胞钙化的临床防治提供新的思路。
方法：大鼠胸大动脉VSMCs传代培养后，将实验细胞随机分为3组。A组：对照组；B组：钙化组；C组：干预组（简称CsA组）。A组给予正常对照的DMEM培养基3ml,B组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的DMEM培养基3ml,C组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的DMEM培养基3ml同时加入浓度为5mg/L的免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)30ul，分别培养6天，每3天换液一次，于第6天收集细胞。茜素红染色示钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形，排列紊乱，可见大量褐色钙化点，提示细胞钙化成功。取材后每组用ELISA法测定大鼠主动脉VSMCs CaN活性、Ca2+含量，实时荧光定量反转录PCR法测定CaNB mRNA和IP3RⅠmRNA, Western blot法测定CaNB及IP3RⅠ蛋白定量，采用比色法测定碱性磷酸酶(ALP)活性；所有数据以均数±标准差（-x±s）表示，运用SPSS13.0统计软件，首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验，组间资料比较应用单因素方差分析，两两比较应用LSD-t检验，P＜0.05即有统计学意义。
结果：
(1)茜素红染色结果示对照组大鼠主动脉VSMCs呈梭形，排列整齐，未见钙化点；钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形，排列紊乱，可见褐色钙化点；CsA组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形，排列紊乱，也可见大量褐色钙化点。
(2)实时荧光定量反转录PCR法结果显示：CsA组与对照组对比：CsA组CaNBmRNA(3.38±0.77)较对照组（1.10±0.28）表达显著增加(P＜0.01)；CsA组IP3RⅠmRNA(2.58±0.53)较对照组（1.02±0.15）表达显著增加（P＜0.01）；钙化组与对照组对比：钙化组CaNB mRNA(6.27±1.45)较对照组（1.10±0.28）表达显著增加（P＜0.01）；钙化组IP3RⅠ mRNA表达（5.90±1.41）较对照组（1.02±0.15）表达显著增加（P＜0.01）；钙化组与CsA组对比：CsA组CaNBmRNA（3.38±0.77）较钙化组（6.27±1.45）表达显著减少(P＜0.01)。CsA组IP3RⅠ蛋白（2.58±0.53）较钙化组（5.90±1.41）表达显著减少(P＜0.01)。
(3)Western blot法测定结果显示：CsA组与对照组对比：CsA组CaNB1蛋白（48.22±2.47）较对照组（29.9±1.39）表达显著增加(p＜0.01), IP3RⅠ蛋白(1155.10±71.42)较对照组（397.87±39.94）表达也显著增加(p＜0.01)；钙化组与对照组对比：钙化组CaNB蛋白（69.11±2.51）较对照组(29.9±1.39）表达显著增加(p＜0.01)，IP3RⅠ蛋白（1865.40±128.57）较对照组（397.87±39.94）表达显著增加(p＜0.01)；CsA组与钙化组对比：CsA组CaNB蛋白（48.22±2.47）较钙化组（69.11±2.51）表达显著减少(p＜0.01)，IP3RI蛋白（1155.10±71.42）较钙化组（1865.40±128.57）表达显著减少（p＜0.01）。
(4)ELISA法测定大鼠主动脉VSMCsCaN活性：钙化组（21.47±1.86IU/L）较对照组（14.31±0.24IU/L）表达显著增加(P＜0.01)，CsA组（15.34±0.14IU/L）较对照组（14.31±0.24IU/L）表达无显著变化(P＞0.05)，CsA组（15.34±0.14IU/L）较钙化组(21.47±1.86IU/L)表达显著减少(P＜0.01)。
(5)ELISA法测定大鼠主动脉VSMCsCa2+含量：钙化组（9.01±0.32pg/ml）较对照组（6.03±0.33pg/ml）Ca2+浓度显著增加（P＜0.01），CsA组（10.39±0.70pg/ml）较对照组（6.03±0.33pg/ml）Ca2+浓度显著增加（P＜0.01），CsA组（10.39±0.70pg/ml）较钙化组（9.01±0.32pg/ml）Ca2+浓度显著增加（P＜0.05）。
(6)用比色法测定细胞内ALP活性(U·g-1 protein)，相对于对照组（38.74±2.23），钙化组的ALP活性（146.04±9.02）显著增高（P＜0.01），但比CsA组（216.69±14.0）其ALP活性显著降低（P＜0.01）；CsA组（216.69±14.0）较对照组（38.74±2.23）显著增高(P＜0.01)。
结论：
1.本实验采用磷酸二氢钠成功地建立了大鼠主动脉VSMCs钙化模型。
2.本试验发现钙化VSMCs中IP3RⅠ及CaN mRNA、蛋白的表达明显增加，应用CsA后IP3RⅠmRNA和蛋白的表达减低，说明在钙化细胞中CaN对IP3RⅠ有激活作用。3CsA可能促进细胞钙化。
血管平滑肌细胞;动脉钙化;心脑血管疾患;磷酸二氢钠;细胞钙化调节;钙调神经磷酸酶;三磷酸肌醇受体Ⅰ;环孢霉素A
河北医科大学
硕士
内科学
李绍冰
2011
中文
R592;R363.2
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2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）