嗜肺军团菌多位点序列分型及脉冲场凝胶电泳分析
目的：研究嗜肺军团菌菌株间的分子特征，对不同地区来源的嗜肺军团菌进行分子分型研究，构建本地区SBT(sequence-based typing)数据库与DNA指纹图谱库，与国际SBT数据库比对，了解本地区与国内嗜肺军团菌分子进化情况及亲缘关系，为研究本菌的生物进化和种群结构的分析积累资料；于分析菌株之间的相关性，从而了解菌株的同源性，协助追踪感染来源，还有助于识别散发病例的传染源，可对已确认的暴发疫情进行传染源的追踪，从而有效预防疫情的再次发生。
方法：
1.嗜肺军团菌SBT基因分型1.1 DNA提取：将细菌加入到0.5ml灭菌水中，100℃煮沸8min，迅速冷却，10000 r/min离心3min后，取上清液作为初始PCR扩增的模板DNA。
1.2 引物合成及PCR反应条件的优化：合成7对引物，分别为嗜肺军团菌的7个等位基因flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA、neuA。设置退火温度范围为50℃-60℃的12个温度梯度，优化退火温度。
1.3 将PCR产物纯化和测序：经毛细管电泳确定PCR扩增产物的纯度和浓度后，送上海生工进行产物纯化和测序。
1.4 测序结果校对和序列拼接及在线提交到EWGLI数据库：测序结果经Chromas软件校对、Clustal1.81拼接后分析并上传到数据库(http://www.hpa-bioinformatics.org.uk)进行比对，得到对应的等位基因号及ST型。
1.5 绘制种系进化树：将Clustal1.81拼接后的7个等位基因的片段共3424bp拼接后，做出neighbor-joining种系发生树。并到SBT数据库中收集国内现有的嗜肺军团菌ST图谱，将结果用MEGA4.0.2软件制作嗜肺军团菌种系进化树井进行分析。
2.嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳分析2.1细菌的培养及浓度测定：取48h嗜肺军团菌的纯培养物加入到1ml细胞悬浮液中，调整壁桌之为4.0个麦氏单位。
2.2 胶块包埋：将菌悬液与等量的1％Seskem Gold:1％SDS混匀加入模具，室温凝固制成胶块。
2.3 胶块中细菌裂解：将胶块放入细胞裂解液中裂解2h，用纯水洗两次胶块，每次10min，用TE洗四次胶块，每次15min。
2.4 酶切：配制预酶切缓冲液平衡15min后，用AscⅠ酶切液酶切胶块4h。
2.5 电泳：将小胶块放于梳子齿上，制备1％Seskem Gold，设置电泳参数进行电泳。
2.6 图像获取2.7电泳图像分析和结果聚类分析：所有菌株的PFGE图像用BioMumerics(Version4.0)数据库软件处理，读取数据后应用统一的MarkerH9812进行校准后聚类分析。
结果：
1.嗜肺军团菌SBT基因分型
1.1 ST型分布：有1株嗜肺军团菌属于一个新的序列型(ST)，有1株由于neuA基因缺失未能分型，有1株ST345型国内没有报道，国际上有发现，其余均为ST1型。
1.2 种系发生树分析：ST（未分型）与其他菌株的亲缘关系较远，与其他菌株分属不同的种系，J1(ST new)与20094-6(ST345)亲缘关系较近，属于同一个种系。其余32株菌均为ST1型，是国内环境来源的嗜肺军团菌优势菌株，且在我国长期流行。
2.嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳分析
2.1 电泳结果：电泳后可得到8条左右大小为40kb～700kb的电泳条带；25株嗜肺军团菌进行限制性内切酶AscⅠ酶切后，得到13个PFGE带型，其中以SJZLP0006(7株)带型为主，此带型的菌株占分离菌株的28.0％．
2.2 聚类分析结果：所有血清1型的菌株均聚类到一起，菌株间相似性系数为60～100％;血清2-14型的菌株均聚类到一起，菌株间相似性系数为80～100％（见表1）。同一血清型别的带型差别相对较小，说明石家庄地区嗜肺军团菌基因组AscⅠ酶切位点的遗传变异较小。
结论：
1.SBT分子分型方法重复性好，可以用于石家庄市嗜肺军团菌分子进化情况及亲缘关系的分析。
2.嗜肺军团菌的同源性分析可以用脉冲场凝胶电泳分型技术，且分型率较高，可以用于疫情的爆发溯源。
嗜肺军团菌;多位点序列分型;脉冲场凝胶电泳;分子分型;传染源;SBT;PFGE
河北医科大学
硕士
流行病学与卫生统计学
周吉坤
2011
中文
R517.9;Q93-331
59
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）