重组人促红素的生产工艺研究
20世纪50年代初人们就认识到肾脏可以产生一种激素，刺激红细胞生长，称为促红细胞生成素（简称EPO），主要由肾脏近曲小管附近的细胞合成和分泌，它的基本生理功能是刺激骨髓红细胞的生成和释放，由于红细胞没有细胞核、线粒体、核糖体等细胞成分，不能通过自身分裂增殖，因此“自身生成促红素”是人体产生红细胞的唯一途径。而人体中EPO是作为促使造血干细胞生成的重要部分，其含量的多少直接影响红细胞生成的数量。
1985年科学家应用人工重组方法合成了EPO，称为重组人促红素(rhEPO)。至今已广泛应用于各型肾脏病贫血患者的治疗并取得十分满意的结果。自1997年国内开始自主生产重组人促红素以来，质量得到了不断提高，与进口产品的差距也越来越小，但随着产品市场价格的不断降低，消费者对质量要求的不断提高，需要对生产工艺进行进一步摸索、优化，在保证产品质量的前提下，降低生产成本。
目的：
本研究以重组人促红素为研究对象，分析重组人促红素的质量情况，并采取有效手段对重组人促红素的质量情况进行监控。同时对生产工艺进行优化，达到提高质量、降低成本的目的。
方法：
1.重组人促红素质量情况的检测通过对样品的关键质量指标进行生物学活性（体内比活性）、免疫学活性（体外比活性）、唾液酸含量测定和等电聚焦分析，找出几项检测指标的关系，进而为快速检测产品质量提供参考。有利于在产品工艺改进中检测产品的质量情况。
2.细胞扩增期血清的筛选实验通过在rhEPO生产种子细胞扩增阶段进行培养基中不同类型血清的选择实验，摆脱生产血清依赖进口的胎牛血清的现状。
3.细胞扩增期添加因子及其比例的筛选通过在rhEPO生产种子细胞扩增阶段添加不同氨基酸，观察细胞生长状态，筛选适合细胞生长的氨基酸。
利用筛选的类胎牛血清添加不同浓度合适的氨基酸类型，进行细胞扩增阶段不同氨基酸及其浓度的选择。
4.维持期无血清培养基的筛选在维持阶段细胞培养中添加血清会给后续纯化过程带来诸多不便，随着细胞培养技术的发展，无血清培养基逐渐成为细胞培养中的主流。本实验通过筛选不同厂家无血清培养基，并对细胞产物进行检测，确定最适合本单位细胞生长的无血清培养基。
5.连续培养期收获最佳温度的筛选细胞培养的维持阶段是细胞分泌代谢产物的关键阶段，通过摸索细胞收获阶段的最佳条件，严格控制培养温度，保证产品收率。
6.不同阶段中间体稳定性的考察对生产工艺不同步骤获得的中间体：收液、反相前中间体、DEAE收液分别放置不同时间后，进行相应后续的纯化过程，得到原液后测定其唾液酸含量、生物学活性，考察存放时间对糖基化的影响。
结果：
1.重组人促红素质量的检测方法研究通过相关性的分析，唾液酸与体内比活性显著相关，而与体外比活性不相关.同样体内比活性与体外比活性在唾液酸含量低时也不相关，而在唾液酸含量高时也有一定的相关性。同时唾液酸含量和IEF有一定相关性，IEF图谱中酸性带多的唾液酸含量高。因此可以用唾液酸含量及等电聚焦的测定代替耗时长、误差大的体内比活性测定，从而快速反映制品的质量水平。
2.细胞扩增期血清的筛选实验本部分通过对细胞培养扩增时期的血清进行了筛选，选择出了与进口胎牛血清相似的国产类胎牛血清。作为进一步实验的基础。
3.细胞扩增期添加因子及其比例的筛选结合上一部分实验的成果，通过筛选在培养基中加入氨基酸类型及加入浓度，筛选出的氨基酸为丝氨酸，用量为0.05g/10L，配上选择的类胎牛血清能在细胞扩增期达到与进口胎牛血清类似的效果。为降低血清成本监定基础。
4.维持期无血清培养基的筛选通过对细胞维持培养期进行无血清培养基的筛选。选择出EXCELL-302是较适合本公司细胞生长的。
5.连续培养期收获最佳温度的筛选通过对细胞维持期培养温度的选择，发现37℃条件下更有利于CHO细胞的生长与产物的分泌。
6.中间体存放稳定性的考察通过对不同中间体存放时间的考察，培养收液的中间体在放置2周后，反相层析前中间体在放置1周后；DEAE前中间体在放置2天后再进行纯化所得原液的质量将受到很大影响。
结论：
在rhEPO的检验中，由于体内活性与唾液酸和含量有一定的相关性，而唾液酸含量也能在等电聚焦图谱中得到体现，因此可以用唾液酸含量、等电聚焦来快速反应制品某些方面的质量。
在细胞扩增阶段可以用国产类胎牛血清结合一定浓度的氨基酸来代替进口胎牛血清进行细胞培养；且在细胞维持培养期培养基和培养温度对产品质量和收率有重要影响。在实际生产中还应严格控制各步中间体的放置时间，以保证产品质量。
重组人促红素;生产工艺;质量监控;唾液酸含量;等电聚焦;生物活性
河北医科大学
硕士
药剂学
贺建功
2011
中文
R977;TQ464
46
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）