禽源NDV Hbnu株分离培养鉴定、F基因测序分析
目的：新城疫病毒(Neweastle disease virus， NDV)属副粘病毒科Avulavirus属，为单股负链RNA病毒，由Doyle于1927年首次分离并命名。NDV能够在禽类中引起一种致死率极高的急性接触性传染病----新城疫，鸡、火鸡及野鸡等都有易感性。NDV在极少数情况下可以感染人类，表现为轻微的结膜炎或温和的呼吸道症状，目前没有发现人到人的水平感染，但近些年来新城疫病毒更多的是以其抗肿瘤作用强、对人安全性高等特点吸引着越来越多的关注。NDV能感染多种人类肿瘤细胞且不依赖于肿瘤细胞增殖而独立复制繁殖，肿瘤细胞不能发挥有效的抗病毒作用是因为干扰素信号转换途径的损伤，从而使NDV在细胞中生长复制，进一步杀伤肿瘤细胞。本实验的研究对象为未知序列的新城疫病毒HBnu株，目的在于通过分子生物学、细胞学及信息技术方面的方法对其F基因序列进行比对分析，也出于对实验室安全的考虑，分析F基因112～117位点，可以确定其型别及致病性、抗肿瘤细胞选择性等。
方法：选取本校分离自圈养禽类的HBnu株（2008年分离），接种鸡胚以扩增病毒，48h后收取鸡胚尿囊液，测定血凝效价≥1:1280后，其血凝性均可被NDV的阳性血清所抑制而不被禽流感(H9和H5)单因子阳性血清及EDS-76阳性血清抑制。采用红细胞吸附释放法纯化病毒，使其血凝效价≥1:1280，常规复苏人传代食道癌细胞ECA109细胞进行细胞学实验，复苏后选择生长状态良好，密度较大的进行NDV HBnu株感染试验，观察其抗肿瘤效果，选择最好溶瘤效果的病毒液进行分子生物学研究，用RNA试剂盒提取病毒RNA后，逆转录合成cDNA。根据GenBank上所公布的新城疫病毒的全基因组序列和相关参考文献，采用Primer5.0系统设计3对引物，引物设计采取使扩增片段之间部分相互重叠的原则，使片段连接起来可以覆盖整个病毒基因组，特异性片段的PCR产物纯化并测序，从而获得F基因组序列，并通过生物信息学软件对其与其他NDV国际毒株进行了比较分析，绘制系统发育进化树，确定NDV HBnu株的分子生物学特征及进化关系，其关键序列为：112G-K-Q-G-R-L117，符合国际标准弱毒株规律，判定NDV HBnu株为弱毒株。
结果：NDV HBnu株第一次经过SPF鸡胚扩增后测定的血凝效价，第二次经过红细胞吸附释放法后测定的血凝效价后测定的血凝效价均≥1:1280，得出NDV HBnu株的HA蛋白功能完整，具有凝血活力，初步验证该病毒株具有正常的病毒毒力。
通过对ECA109细胞感染后的凋亡实验，再次证明NDV HBnu株具有细胞杀伤作用，而且病毒毒力正常。
NDV HBnu株F基因序列均由1707个碱基组成，属于基因Ⅱ型，与GenBank公布的clone30株和LaSota弱毒株的F基因序列长度相近，通过序列的比较分析，发现clone30株和LaSota弱毒株的同源性较高，属于进化树同一分支。NDV HBnu株的F基因关键位点112～117为GlyLys-Gln-Gly- Arg-Leu符合国际标准弱毒株规律，判定NDV HBnu株为弱毒株。
结论：
1.NDV HBnu株是一株具有杀伤肿瘤细胞且具有正常病毒毒力的毒株，抗肿瘤细胞的选择性主要在消化道上皮癌细胞最为突出，符合弱毒株的特性。
2.NDV HBnu株F基因组序列由1707个碱基组成，属于基因Ⅱ型弱毒力病毒株。
3.NDV株与其他GenBank上公布的24株毒株比较，核苷酸同源性在73％-95.5％之间，氨基酸同源性在50.7％-90.6％之间。
4.NDV HBnu株与基因Ⅱ型国际标准弱毒株clone30株和LaSota株在系统发生进化树同一分支上，具有亲缘关系。
禽源NDV;新城疫病毒;HBnu株;副粘病毒科;分离培养鉴定;F基因序列;抗肿瘤
河北医科大学
硕士
病原生物学
张进顺;刘开扬
2011
中文
S852.659.5
46
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）