黄芪多糖对尿路细胞免疫功能的调节作用研究
目的：尿路感染(Urinary tract infection， UTI)是临床常见的感染性疾病之一，女性较为多见。其已成为慢性肾功能不全的主要病因。然而，近年来由于抗生素耐药的逐年增加，感染菌在尿路细胞内的长期定居以及机体尿路免疫失衡等原因严重影响了单一抗生素治疗的效果，临床治疗出现了困境，也增加了患者的身心痛苦。因此，寻找并开发抗生素以外的治疗方案，是应对UTI的新策略。
尿路固有免疫是机体预防病原菌侵入的重要屏障，起着抵抗微生物的防御作用。TLR4在尿路细胞固有性免疫中扮演重要角色，其在尿路主要表达于膀胱上皮细胞和肾小管上皮细胞。TLR4与其配体结合后，可以通过MyD88依赖或cAMP/CREB信号转导途径，活化尿路细胞，调节多种细胞因子的表达，发挥抵抗细菌入侵，促进细菌排出等固有性免疫作用。
前期的临床调查研究已发现中药黄芪能够通过上调慢性尿路感染患者TLR4的表达提高机体的免疫能力，提高治疗效果。而黄芪是多种化学成分的混合物，黄芪多糖(Astragalus polysaccharides， APS)作为黄芪的主要成分，也是TLR4的配体，其是否能够通过TLR4调节尿路粘膜免疫功能的研究还鲜有报道。
本研究旨在将黄芪多糖作用于膀胱上皮细胞株5637细胞、肾小管上皮细胞株A498、人单核细胞型淋巴瘤THP-1细胞及小鼠后，探索黄芪多糖对尿路细胞TLR4表达、细胞因子的分泌、抗菌效应、与LPS的竞争作用以及小鼠膀胱炎症反应强度的影响，进一步研究黄芪多糖调节尿路粘膜免疫功能的机制，为尿路感染的免疫调节、治疗提供实验依据。
方法：
1.TLR4表达的检测：将不同浓度的黄芪多糖及黄芪多糖与LPS的混合物分别与5637细胞、A498细胞、THP-1细胞共培养48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞表面TLR4的表达；
2.5637细胞的抗侵袭作用：不同浓度的黄芪多糖及黄芪多糖与LPS的混合物刺激5637细胞48小时后，加入大肠杆菌U30共培养1小时，彻底洗去未侵入细胞的大肠杆菌，将侵入细菌的细胞用0.5％的TritonX-100溶解，溶解液稀释后LB平板培养过夜，进行菌落计数；
3.实时定量PCR检测细胞因子的表达：黄芪多糖作用于5637细胞、A498细胞、THP-1细胞，以及感染模型小鼠膀胱和肾组织，提取总RNA，反转录为cDNA，实时定量PCR测定IL-6、IL-8、TNF-α、MyD88的mRNA表达。
4.动物实验：8周龄Balb/C雌鼠随机分为2组，对照组和实验组，每组15只。大肠杆菌U30株经LB液体培养基48小时静置培养，生理盐水洗涤，以每只108CFU/50μl的菌量，经小鼠尿道注入膀胱。感染6小时后，对照组，腹腔注射生理盐水，100μl/只；实验组，腹腔注射黄芪多糖注射液，每只200mg/kg，每天一次，共注射3天。
5.膀胱内细菌的菌落计数：处死小鼠，将膀胱剪碎后用TritonX-100溶解，溶解液稀释后涂布于固体LB平板培养基，37℃温箱孵育过夜，进行菌落计数。
6.制作感染小鼠膀胱、肾组织切片，HE染色，光学显微镜观察炎症细胞浸润现象。
结果：
1.黄芪多糖作用于5637、A498和THP-1细胞48小时后，三种细胞表面TLR4表达均有显著增加。不同浓度的APS作用于5637细胞后，与对照组相比，均能刺激TLR4表达增加(P＜0.05)，但不同浓度间没有显著差异(p＞0.05)；黄芪多糖与LPS混合后，仍可刺激TLR4表达增加(P＜0.05)，与APS单独刺激相比有显著差异(P＜0.05)，而与LPS单独刺激相比无显著差异(p＞0.05)。APS以100μg/ml的浓度作用A498和THP-1细胞48小时后，与对照组相比，也能显著刺激两种细胞TLR4表达上调(P＜0.05)。
2.5637细胞抗侵袭实验显示：APS以20μg/ml、100μg/ml作用于5637细胞48小时后，U30细菌感染细胞，细胞内侵入的细菌数分别为70.45±15.5，82.73±38.25，显著低于空白对照组234.9±115，(P＜0.05)，不同浓度的APS与2μg/ml LPS共同作用5637细胞，细胞内细菌数也显著低于对照组，且随着APS浓度增高(20、100、500μg/ml)，细胞内细菌数呈下降趋势。
3.Real-time PCR检测显示，5637细胞经100μg/ml的APS刺激后，IL-6和IL-8mRNA表达均明显低于空白对照组(P＜0.05); LPS与不同浓度的APS共同作用5637细胞，与对照组相比，IL-6、IL-8mRNA表达也显著降低(P＜0.05)，但不同APS浓度组间比较无显著差异。A498细胞经100μg/mlAPS刺激后，IL-6和IL-8mRNA表达量比空白对照组明显降低(P＜0.05)，而THP-1细胞经100μg/mlAPS刺激后，IL-6、TNF-α、MyD88与空白对照组相比，显著升高(P＜0.05)。
4.大肠杆菌感染小鼠，膀胱和肾脏经Real-time PCR检测，APS治疗组IL-6mRNA的相对表达与空白对照组比较无明显差异(P＞0.05)；而TNF-α表达量与空白对照组比较有所上升(P＜0.05)。
5.小鼠膀胱内感染的菌落计数显示，注射APS的小鼠膀胱内细菌数明显低于生理盐水对照组(P＜0.05)，其数值分别为APS组56.67±20.81，生理盐水对照组140±52.92。
6.感染小鼠膀胱组织经HE染色显示，注射APS组小鼠膀胱组织与对照组相比，炎细胞浸润显著低于对照组膀胱，粘膜层较平滑、完整。
结论：
1.黄芪多糖能明显促进5637细胞、A498细胞和THP-1细胞表面TLR4的表达，各浓度之间无显著差别。
2.黄芪多糖可显著增强5637细胞抵抗U30侵袭的能力，且在LPS浓度不变的情况下，抗侵袭能力随着APS浓度的提高而增加。
3.黄芪多糖可明显降低5637细胞和A498细胞IL-6、IL-8mRNA的表达。但可促进THP-1细胞IL-6、TNF-α mRNA的表达，且可能经MyD88信号转导途径诱导。
4.黄芪多糖能够提高小鼠抵抗大肠杆菌U30的感染能力，并能改善尿路感染后小鼠膀胱的炎症反应强度。
黄芪多糖;TLR4;尿路细胞;尿路感染;粘膜免疫功能;免疫治疗
河北医科大学
硕士
免疫学
尹晓琳
2011
中文
R691.3;R284.1
68
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）