糖尿病足患者外周血基质金属蛋白酶-2和-9表达的研究
目的：糖尿病足(Diabetic foot，DF)难愈溃疡的基本病理改变，主要表现为溃疡处基质不能沉积，胶原蛋白过度分解，不能填充创面，角质细胞不能移行到创面，并伴有局部缺血缺氧，炎性细胞侵润，及微生物感染等，使溃疡向深和广扩大。而降解细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的主要依靠基质金属蛋白酶家族(Metalloproteinases，MMPs)的调控。已有的报道发现创面MMPs及其组织抑制因子(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase，TIMP)失去正常的动态平衡，MMPs增加，TIMP下降，并发现糖尿病大血管病变患者血清中也存在MMPs/TIMP比例异常。糖尿病足溃疡创面取材困难，制约深入研究。本课题对糖尿病足患者外周血标本进行研究，探讨MMPs家族中MMP-2和MMP-9在蛋白、基因水平的变化及其机制，为临床预防和治疗糖尿病足病提供新的研究方向。
方法：
1.随机抽取2007年3月～2009年9月符合入选标准的糖尿病足患者(DF组)78例，男44例，女34例，年龄48～81岁，平均64.3岁；糖尿病病程3～28年，平均14.6年；创面范围0.5cm×1cm～13×4cm;足部溃疡病程2周～5个月，平均1.9个月；111例为非糖尿病足糖尿病对照组(Diabetes without foot ulcers，NDF)，男60例，女51例，年龄52～79岁，平均66.2岁；糖尿病病程5～18年，平均13.1年；健康对照组(CON)，为我院退休职工健康体检者150例，排除糖尿病、糖调节异常，无大血管病变。男79例，女71例，年龄56～82岁，平均65.5岁。NDF、CON组均无足部溃疡或其他部位慢性溃疡史，近3个月内无急性外伤史，并除外心功能不全及严重肝功、肾功不全者。
(1)测定三组TG、CHO、LDL-C、HDL-C、FINS、FPG、HbAIc，计算HOMA-IR，检测静脉全血白细胞计数。ELISA测定测定血清AGEs、MMP-2、MMP-9、TIMP-1浓度。
(2)明胶酶谱法测定各组血清中MMP-2和MMP-9的活性酶表达量。
(3)RT-PCR法分析三组外周静脉血白细胞MMP-2和MMP-9的mRNA表达情况。
(4)两因素两水平的析因分析方法：对所有78例糖尿病足慢性溃疡患者按照TEXAs分类方法进行分期和分类。针对病因分为两类，即感染和缺血。感染性因素(A)有两个水平，有(a1)和无(a2)；缺血因素(B)也是两个水平，有(b1)和无(b2)。判断不同病因对MMPs表达的影响，哪种病因为主效应，两种病因有无交互作用。具体步骤：①将2×2析因处理看做4个单因素，即甲(TEXAs分类法的D期)=a1b1，乙（B期）=a1b2，丙（C期）=a2b1，丁(A期)=a2b2。②采用完全随机设计，将符合每一个单因素的DF患者按照完全随机法进入析因分析。③每个单因素组中DF患者4例，共16例。
2.1999年3月—2009年9月我院内分泌科门诊及住院的新诊断的DF患者242例，所有DF均为首次发生足部溃疡。采用前瞻性研究方法，对242例入选的DF分别采用Wagner分级法和TEXAS大学分类法分类，参照美国ADA糖尿病足协助组对DF检查和危险因素的评估方法诊断下肢动脉缺血和周围神经病变，判断溃疡性质为神经性、神经缺血性、缺血性及非神经非缺血性溃疡。病情稳定出院及门诊治疗的患者每周随访一次，观察随访期为6个月，在此期间内溃疡痊愈、截肢及死亡为终点事件。
结果：
1.DF、NDF和CON组一般情况的比较
DF、NDF和CON组的年龄、性别及民族等因素无统计学差异，吸烟史在3组之间比较未达统计意义，具有可比性；DF组并发大血管病变者为59例（患病率为75.6％），NDF组并发大血管病变者为80例(72.1％)；DF组并发微血管病变者为45例(57.7％)，NDF组并发微血管病变者为68例(61.3％)；DF和NDF两组血管并发症（大血管及微血管并发症）发生率无统计学差异(x2大血管=0.5466，P=0.4597;x2微血管=0.247，P=0.6223)，具有可比性；DF和NDF两组血压均高于CON组，DF与NDF之间差别无统计学意义。
2.生化指标的比较
与对照组相比，糖尿病两组FPG、HbA1C、TG、CHO、AGEs、WBC计数、HOMA-IR、MMP-2、MMP-9均明显升高（P＜0.05）。NDF组和DF组FPG、HbA1C、AGEs和TG比较差异无统计学意义（P＞0.05）。全血WBC计数，三组逐渐升高：（4.35±0.47）×109/L，（6.17±0.84）×109/L，（7.62±1.13）×109/L，两两比较具有统计学意义(P＜0.05)；NDF组AGEs93±10.5mg/L，DF组106.5±22.9mg/L，均高于CON35.1±7.3mg/L;NDF组TIMP-1均值334.5μg/L虽低于CON组378.8μg/L，但差异未达到统计学意义（P＞0.05），MMP-2/TIMP-1比值在两组间也无统计学差异(P＞0.05)；DF组MMP-2水平81.7(48.8)μg/L、MMP-2/TIMP-1比值0.3(0.1)，高于NDF组[46.1(18.2)μg/L，0.1(0.1)]；DF组TIMP-1水平252.5(131.6)μg/L，低于NDF组378.8(190.0)μg/L;DF组MMP-9水平624.4(485.3，994.6)μg/L高于NDF组136.1(107.4，275.1)μg/L，均具有统计学差异（P＜0.05）。
3.MMP-2与其他各指标的Spearman秩相关分析及回归分析Spearman秩相关显示，MMP-2血清水平与HbA1C（r=0.387）、TG(r=0.169)、AGEs(r=0.221)、病程(r=0.214)、SBP(r=0.135)呈正相关(P＜0.05)，与TIMP-1血清水平呈高度负相关（r=-0.852，P＜0.05）；与WBC计数的相关系数r=0.014，P＞0.05，无统计意义。经多元线性逐步回归分析，最优回归方程为：LnMMP-2=6.264-0.591×LnTIMP-1+0.392×Ln（病程）+0.281×HbAlC+0.152×年龄。
4.DF危险因素Logistic回归分析以有无DF为应变量y，病程、血管并发症、吸烟史、MMP-2/TIMP-1比值、MMP-2、FPG、HbA1C、AGEs、WBC计数、血脂、血压、和胰岛素抵抗指数等作为自变量，进行Logistic回归分析。MMP-2、大血管并发症、糖尿病微血管并发症和TG进入回归方程，是DF的独立危险因素。
5.MMP-9与其他各指标的Spearman秩相关分析及回归分析 MMP-9与AGEs的相关性不强，r=0.281，P＜0.05;MMP-9血清水平与WBC计数呈较强正相关，r=0.776，P＜0.05。LnMMP-9为应变量的回归分析，最优回归方程为：LnMMP-9=3.475+0.612×AGEs+0.435×WBC+0.281×Ln(病程)+0.041×年龄。
6.以高MMP-9水平为暴露因素，计算高MMP-9的糖尿病患者发生DF的相对危险度(OR值)。血清MMP-9资料属偏态分布，用百分位数法计算对照组MMP-9的上侧界值(95百分位数)为169.6μg/L，即血清MMP-9水平＞169.6μg/L，定义为高MMP-9血症。采用病例对照研究资料的四格表形式计算OR值。OR=20.682，OR值的可信区间为(8.955，47.767)。(x2=66.534)说明糖尿病患者血清MMP-9升高患糖尿病足溃疡的风险是非升高者的20倍。
7.明胶酶谱测定结果显示，MMP-2和MMP-9的活性在CON、NDF和DF组表现不同，MMP-2酶的比活性分别为0.4±0.0、7.0±3.3、8.2±4.5(A·mm2·g-1·L-1)，糖尿病组两两比较未发现差别(P＞0.05)。活性MMP-9酶的比活性逐步升高，三组分别为1.5±0.3、17.0±6.8和40.1±8.3(A·mm2·g-1·L-1)，两两比较有统计学意义(P＜0.05)。
8.前瞻性研究中242例DF中痊愈者147例(60.7％)，截肢者48例(19.8％)，未愈者34例(14.0％)，死亡13例(5.4％)。全部愈合病例的愈合时间中位数M=8.4周，QR=14周。3例缺血性溃疡在观察期内采用自体骨髓干细胞移植术（2例），血管成形术（1例），在随访结束前愈合，术后愈合时间分别为7.6、10、4.8周。
9.Wagner分级方法：随着分级升高，截肢率升高，分级与截肢率存在正趋势(x2趋势=79.6420，P＜0.001)；TEXAS大学分类法：随分期升高，截肢率升高，分期与截肢率存在正趋势(x2趋势=32.8046，P＜0.001)，分级与截肢率也存在正趋势(x2趋势=39.2448，P＜0.001)
10.比较不同病因(TEXAS大学分类法的分期)发生截肢的风险
记录242例DF患者6个月内截肢发生的情况，截肢率A期1.4％、B期29.8％、C期10.8％、D期41.2％。比较缺血性溃疡（C+D期，截肢率为28.4％）与非缺血性溃疡（A+B期，截肢率16.9％）其风险增加近2倍[RR=1.954，95％CI(1.044，3.655)]；而合并感染和缺血的溃疡(D期)较无缺血、感染的溃疡(A期)发生下肢截肢的风险增加48倍[RR=48.300，95％CI(6.209,375.703)]。
11.比较溃疡愈合时间与分级和分期的关系，经过log-rank检验仅TEXAS大学分类法的分期对溃疡愈合时间有影响（log-rank检验x2=11.234，df=3，P=0.012）。Wagner和TEXAS大学分类法的不同分级溃疡愈合时间经检验未达到统计学意义(P值均＞0.05)
12.CON、NDF和DF组MMP-2、MMP-9mRNA的表达区别
CON组WBC的MMP-2、MMP-9mRNA表达为0；NDF组MMP-2mRNA表达微弱为相对水平为0.07±0.01，MMP-9mRNA表达略强为0.53±0.05;DF组MMP-2mRNA表达较NDF组为高，但仍较弱0.27±0.09，两两比较达到统计学意义(P＜0.05)，MMP-9mRNA表达较为显著7.42±3.39，较NDF组(0.53±0.05)显著升高(F=81.485，P＜0.0001)。
13.析因实验设计的方差分析结果
感染和缺血因素对DF患者的MMP-9mRNA表达均具有影响，效应达到统计学意义。感染可使糖尿病足患者外周血WBC的MMP-9mRNA表达水平平均增加7.17，缺血可增加糖尿病足患者外周血WBC的MMP-9mRNA表达水平平均增加2.73，两者存在正协同作用。结合4个分期的MMP-9mRNA表达的均数情况，可以认为感染因素对于DF患者WBC MMP-9的mRNA表达起主要作用，缺血也有较重要的作用，两者有协同促进WBC的MMP-9表达作用。
总的方差：F=96.57，P＜0.0001;感染因素：F=23.41，P＜0.0001;缺血因素：F=34.63，P＜0.0001;交互作用：F=17.66，P=0.0012。
14.应用SNK-q法比较TEXAs大学分类法2级、3级、4级溃疡患者WBCMMP-9mRNA表达差异，发现此三组MMP-9mRNA表达无明显差异（两两比较P值均＞0.05）
结论：
1.糖尿病患者未发生足部溃疡前，血清MMP-2即开始升高，糖尿病足溃疡患者血清MMP-2明显升高，伴有TIMP-1水平下降，MMP-2/TIMP-1升高；MMP-2与TIMP-1高度负相关，与糖尿病病程和HbA1C正相关；MMP-2升高是糖尿病足的独立危险因素。
2.糖尿病患者发生DF前血清MMP-9浓度较同龄健康对照组升高1.5倍，DF血清MMP-9升高达7倍；MMP-9血清水平与WBC计数呈较强正相关；糖尿病患者血清MMP-9升高患糖尿病足溃疡的风险是非升高者的20倍。
3.明胶酶谱发现MP-2和MMP-9的活性不同：糖尿病足患者血清MMP-2活性弱，而MMP-9活性相对较强。
4.TEXAS大学分类法较Wagner分级法更为全面的评估糖尿病足预后，有更强的预测价值，容易分级和分期，值得在临床推广应用。
5.糖尿病足外周血白细胞在mRNA水平强表达MMP-9，但是MMP-2表达较弱。感染和缺血因素对DF患者的MMP-9mRNA表达均具有影响，感染因素对于DF患者WBC MMP-9的mRNA表达起主要作用，缺血有较重要的作用，两者有协同促进WBC MMP-9表达作用。足部溃疡患者外周血WBC的MMP-9mRNA表达量与溃疡深度无明显关联。
糖尿病足;慢性溃疡;基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶抑制因子-1;糖化血红蛋白;明胶酶谱;Wagner分级法
河北医科大学
博士
内科学
房辉
2011
中文
R587.2;R446.11
115
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）