快速老化小鼠SAMP8老化过程中自噬的改变以及mTOR信号通路功能研究
在受累脑区形成细胞内蛋白质聚集体是许多神经退行性疾病的共同特点，如阿尔茨海默病（AD），帕金森病(PD)和亨廷顿病，而这些蛋白质沉积多由泛素分子连接，提示蛋白质降解系统功能障碍。自噬溶酶体系统和泛素蛋白酶体系统（UPS）是大多数脑细胞胞浆内聚集的或错误折叠蛋白的主要降解途径。UPS选择性的降解细胞内短寿命的错误折叠蛋白。而自噬与之相反，其选择性较差，有助于降解长寿命的蛋白质和受损的细胞器（如线粒体），甚至某些细胞外的成分。自噬对保持神经元的内稳态至关重要，因其可以清除老化的有聚集倾向的且对细胞有害的蛋白质，并为蛋白质的合成提供大分子物质。自噬可以分为以下几个步骤：首先包裹待降解底物形成双层膜结构，称为自噬体，之后自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，内容物被溶酶体内的水解酶降解，最后降解产物进入胞浆循环利用。自噬体和自噬溶酶体统称为自噬小泡(AVs)，是自噬的主要形态学特征。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)是自噬的一个抑制因子，是一个细胞内的保守激酶系统，是能量状态、生长因子和营养信号的中心传感器，其活性可以被某些药物抑制，如雷帕霉素等。
AD是一种神经退行性疾病，主要特点为进行性痴呆，形态学改变包括脑萎缩、具有β淀粉样蛋白（Aβ）沉积的老年斑、神经元内具有tau蛋白异常磷酸化的神经元纤维缠结(NFT)。在AD患者的尸检标本中发现脑内营养缺乏而肿胀的突起内聚集了大量AVs，这表明AD的发病过程中有自噬系统参与。在散发性AD和PS1/APP转基因小鼠脑内发病早期自噬被诱导，并不是淀粉样蛋白沉积引起的后果，而大部分的Aβ在AD患者脑内可在溶酶体内正常降解。
老化是AD的主要危险因素，因为细胞和器官由于蛋白质和受损细胞器异常聚积而功能逐渐下降是一个普遍现象。许多证据显示，自噬溶酶体系统的增龄性功能障碍可能是衰老过程中异常蛋白质聚集的原因。老化过程中自噬功能的下降可以决定细胞和个体的寿命。诱导神经元内的自噬，可以使老龄果蝇的寿命延长56％，若抑制自噬，则寿命会缩短，并能观察到神经退行性改变。最近有研究显示，tau蛋白磷酸化可通过PI3K/mTOR信号转导通路进行调节。在AD患者脑内的研究进一步证实了mTOR和Tau蛋白之间的联系，研究表明mTOR信号在有可能生成NFTs的神经元内选择性的增强，并且这种增强与tau蛋白磷酸化相关。这些证据表明，在老化过程中mTOR信号的长期增强可以促进Tau蛋白的病理变化。有研究已经证实，长期给予雷帕霉素或敲除mTOR的靶点p70S6K可以延长小鼠的寿命，可能会起到延缓衰老的作用。
快速老化小鼠（SAMP8）是由日本京都大学竹田俊男教授由AKR/J小鼠开发而来，以学习记忆功能呈增龄性加速衰退为主要特征，该小鼠成为了研究老化和学习记忆障碍的理想哺乳动物模型之一。SAMP8小鼠不但具有一些与老年人相似的特征，如寿命短、驼背、活动减少、毛发稀少等，还具有神经退行性变的特征，如早发的学习记忆障碍、情绪变化、生理节律异常、脑内神经元丢失和神经递质释放减少。SAMR1不表现出这些老化特征，一般作为其对照小鼠。值得关注的是，SAMP8小鼠还具有一些蛋白修饰的改变，如年龄相关的Tau蛋白异常磷酸化和Aβ沉积，与AD患者脑内的变化相似。
到目前为止，还没有关于SAMP8小鼠增龄性脑内自噬活性改变的研究，以及自噬功能的改变是否与其老化和认知功能改变有关。为了更好的理解老化、自噬以及神经退行性变三者之间的关系，在本研究中，我们研究了SAMP8小鼠在老化过程中不同脑区的自噬增龄性改变，并进一步研究了mTOR信号转导通路在SAMP8小鼠老化和神经退行性变过程中的作用。
1、快速老化小鼠SAMP8体内外增龄性神经退行性变
目的：研究SAMP8小鼠脑内体内体外的增龄性的神经退行性变，为下一步研究提供理论基础。
方法：用Morris水迷宫评测2、7和12月龄SAMP8和SAMR1小鼠的学习和空间记忆能力。原代神经元取自新生SAMP8和SAMR1小鼠的海马，在培养第10天进行免疫荧光染色。利用Western-blot检测磷酸化Tau蛋白的水平。
结果：SAMP8和SAMR1小鼠在2月龄时的学习和空间记忆能力无明显差别，与SAMR1小鼠相比，在7(P＜0.05)和12(P＜0.05)月龄时SAMP8小鼠出现明显的学习记忆功能下降。在培养第10天时，SAMP8组神经元细胞状态较差，突起较细且短，部分突起出现断裂，突起上呈现出“串珠样”改变。而对照组SAMR1小鼠则细胞状态较好，无此变化。Western-blot结果显示，在SAMR1小鼠的海马和皮质区Tau[pS199]水平在7(P＜0.05)和12月龄(P＜0.05)均出现了明显增多。而SAMP8来源的神经元在培养10天时Tau[pS199]和Tau[pS396]的水平均较对照组明显提高。
结论：SAMP8小鼠表现出年龄相关的神经退行性变特征，如在7和12月龄时表现出学习和记忆能力下降，Tau蛋白磷酸化水平增高。与SAMR1小鼠相比，新生SAMP8小鼠来源的原代神经元也表现出一定的神经退行性改变。以上结果提示，在本实验室饲养的SAMP8小鼠能够稳定的表现出认知功能下降以及退行性变相关的神经病理学改变，为下一步研究打下了良好的基础。
2、快速老化小鼠SAMP8脑内年龄相关的自噬改变
目的：研究SAMP8小鼠脑内年龄相关的自噬改变以及这些改变是否在其老化以及认知功能下降过程中发挥作用。
方法：利用透射电镜观察SAMP8和SAMR1小鼠海马神经元的超微结构以及AVs的变化。利用免疫组化以及Western-blot观察在2、7和12月龄SAMP8和SAMR1小鼠海马和皮质内泛素阳性蛋白、LC3以及Beclin1的表达。
结果：在海马的CA3和皮质区，7(P＜0.05)和12月龄(P＜0.05)SAMP8小鼠的泛素阳性蛋白的OD值明显高于同龄的SAMR1小鼠。在12月龄的SAMP8小鼠的海马和皮质区泛素阳性蛋白呈现出聚集状态。
透射电镜观察发现，2月龄的SAMP8和SAMR1小鼠海马神经元内线粒体、细胞核以及其他细胞器状态均正常，很少见到AVs。在7月龄的SAMP8小鼠海马神经元内细胞核出现固缩变形，线粒体轻度肿胀、脊和膜轻度消失，内质网肿胀，胞浆内有少量的密度不匀的致密物，可能为降解的细胞器或者脂褐素沉积，有些被双层膜结构包裹，可以观察到少量的双层膜的AVs。而与2月龄的SAMR1小鼠相比，7月龄的SAMR1小鼠海马神经元超微结构无明显变化。12月龄的SAMP8小鼠海马神经元细胞状态很差，出现胞浆空泡化，核质边移，细胞器减少、线粒体数量减少，线粒体肿胀、脊和膜消失，粗面内质网脱颗粒，在胞浆和轴突内可见到大量的致密物以及AVs。而12月龄的SAMR1小鼠则变化较轻微，仅有少量致密物沉积，AVs少见。
在海马CA1和CA3区免疫组化染色发现，与同龄SAMR1小鼠相比，2月龄的SAMP8小鼠的LC3的阳性颗粒较多，但LC3-Ⅱ/β-actin的比值无统计学意义。在7(P＜0.05)和12月龄(P＜0.05)的SAMP8小鼠海马CA1和CA3区免疫组化染色较对照组明显增强，以CA3区较明显，western blot结果提示差异有统计学意义。在皮质区LC3的表达变化与海马区相似，7和12月龄的SAMP8小鼠的表达明显增强。与对照组相比，SAMP8小鼠在海马和皮质区的Beclin1表达在7月龄明显增加，12月龄时出现明显下降。
结论：SAMP8小鼠的大部分神经退行性改变从7月龄开始出现，而自噬活性在7月龄先出现升高，12月龄时出现了明显下降。随着快速老化过程的进展，自噬活性在12月龄时出现下降，这一变化与AD患者的变化类似，提示从自噬这一角度来说，12月龄SAMP8小鼠的病理学改变与晚发性AD更加相似。充分了解SAMP8小鼠自噬活性的增龄性改变有助于进行更深入的研究，如治疗AD以及抗老化的药物研究。
3、mTOR信号通路参与SAMP8小鼠老化过程中自噬活性的调节
目的：探讨mTOR信号通路是否在SAMP8小鼠的神经退行性变过程中发挥作用，给予雷帕霉素是否可改善SAMP8小鼠神经退行性变。
方法：原代神经元培养同前，在培养第7天时加入0.5或1.0μM雷帕霉素，作用3天后进行免疫荧光染色或者Western-blot分析。用Western-blot检测磷酸化p70S6K、总的mTOR、磷酸化mTOR、Bcl-2以及Tau[pS199]和Tau[pS396]的表达变化。
结果：在老龄的SAMP8小鼠海马区mTOR(pSer2448)(P＜0.01)和p70S6K(pThr389)(P＜0.01)的水平较对照组明显提高。
免疫荧光染色结果显示，SAMR1来源的神经元细胞状态较好，突起平滑且较长。而未处理组的SAMP8来源的神经元状态较差，大部分突起断裂，并呈现串珠样改变。加入0.5μM雷帕霉素状态较未处理组好，部分细胞的突起平滑细长，但仍有部分神经元突起断裂或没有突起。加入1.0μM雷帕霉素的SAMP8神经元，细胞状态较未处理更差，大部分细胞没有突起，部分细胞已经死亡。
SAMP8神经元组的Tau[pS199](P＜0.01)和Tau[pS396](P＜0.01)均明显高于对照SAMR1组，给予0.5μM雷帕霉素预处理3天后Tau[pS199]（P＜0.05）和Tau[pS396](P＜0.05)都出现降低。加入0.5μM雷帕霉素可以提高SAMP8神经元内LC3-Ⅱ(P＜0.05)和Beclin1(P＜0.05)的水平，并减少p70S6K(pThr389)(P＜0.05)的水平，对mTOR(pSer2448)(P＞0.05)水平无影响。雷帕霉素可以使神经元内Bcl-2的水平降低。
结论：mTOR信号通路参与了SAMP8小鼠的神经神经退行性变的发生，给予雷帕霉素可以保护神经元，减少Tau蛋白的异常磷酸化。提示雷帕霉素可能可以改善SAMP8小鼠的认知功能下降。
综上所述，SAMP8小鼠在7月龄时开始出现学习和和记忆能力下降，Tau蛋白磷酸化增多，此时待降解蛋白增多，自噬小泡增多，自噬活性提高。在12月龄时SAMP8小鼠学习和和记忆能力持续下降，Tau蛋白磷酸化明显增多，此时细胞内待降解蛋白呈聚集状态，在电镜下可见大量呈团块状的致密物和自噬小泡聚集，说明此时存在着自噬小泡清除障碍，并且出现mTOR信号通路活性提高，均提示老龄SAMP8小鼠脑内自噬活性下降。以上结论均揭示SAMP8小鼠脑内存在着年龄相关的自噬活性改变，自噬可能参与了SAMP8小鼠脑老化过程。而在老龄SAMP8小鼠脑内以及SAMP8来源的原代海马神经元内均存在着自噬活性下降，mTOR通路活性提高，给予雷帕霉素抑制mTOR通路活性后可以保护神经元，降低神经元内Tau蛋白磷酸化的水平，提示mTOR通路参与了SAMP8小鼠老化过程中自噬活性的调节，也进一步证实了自噬参与了SAMP8小鼠脑老化过程这一结论。雷帕霉素的治疗效果目前只在细胞水平得到证实，我们下一步还将进行体内实验验证。然而，这一结论丰富了SAMP8小鼠老化机制的研究，为其更广泛应用奠定了理论基础。
阿尔茨海默病;信号通路;老化过程;神经退行性疾病;神经元
河北医科大学
博士
神经病学
王铭维
2011
中文
R749.16
125
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）