二十碳五烯酸抑制角膜新生血管的实验研究
角膜病占致盲病的第二位，角膜热化学烧伤、感染性角膜炎等是常见角膜病，在其发生发展过程中，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)起着重要作用，常导致严重的视力下降，同时，角膜新生血管破坏了角膜的相对“免疫赦免”状态，是角膜移植发生排斥反应的高危险因素。角膜新生血管的发生机制和治疗是角膜病研究的热点。
角膜新生血管的发生机制有细胞因子平衡学说和炎症学说。细胞因子平衡学说是指在正常情况下，血管形成促进因子和抑制因子处于平衡状态，使角膜保持透明无血管性。一旦炎症刺激等诱因存在时，平衡被打破导致角膜新生血管的产生。在众多的血管形成促进因子中，血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是最主要的促血管生成因子，VEGF通过与其特异性受体，特别是(fetal liver kinase1，Flk-1)Flk-1结合，诱导血管内皮细胞的增殖、移行和血管管腔的形成，发挥其促血管生成作用。炎症学说是指炎症在新生血管的形成过程中起着直接和间接的作用。白细胞介素1α（interleukin1α，IL-1α）和白细胞介素6(interleukin6，IL-6)是重要的致炎细胞因子，核转录因子kB(nuclear factor kappa B，NF-κB)广泛存在于动物细胞中，是调控炎症反应的核心因子，调控靶基因生长因子如VEGF、细胞因子如IL-1α、IL-6的表达，进而导致炎症、细胞的增殖等。
目前治疗角膜新生血管的方法不理想。光凝、光动力治疗会损害正常组织、短期内有效；角膜缘干细胞自体移植术仅适用于单侧眼或双眼局限性角膜缘受损的病例；异体角膜缘干细胞移植术存在移植排斥反应和角膜新生血管再发生的问题；单用羊膜移植不能完全重建眼表。因此，探索新的预防和治疗角膜新生血管方法很有必要。
VEGF，IL-1α和IL-6在角膜碱烧伤中高表达，血管内皮细胞是新生血管因子作用的主要靶细胞，单个核细胞是参与急性和慢性炎症的重要炎症细胞。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞膜上的主要成分，能促进多种细胞分泌致炎细胞因子。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是一种多不饱和脂肪酸，主要来源于鱼油，有其抗肿瘤和抗炎症等报道，未见EPA在角膜新生血管治疗中的报道。本课题以角膜新生血管的发生机制中的两个关键点VEGF和炎症为切入点，模拟角膜新生血管病理状态的体外环境，通过NaOH碱烧伤获得SD大鼠角膜新生血管模型。通过体外实验、EPA毒性试验及体内实验，研究EPA对角膜新生血管的抑制作用、作用机制及安全性。
第一部分二十碳五烯酸抑制血管内皮生长因子诱导人血管内皮细胞增生作用的研究
目的：探讨EPA对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增生的抑制作用。
方法：HUVEC株培养和传代并用Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体进行免疫细胞化学鉴定。用MTT法检测不同质量浓度的EPA作用不同时间后对非VEGF诱导及VEGF诱导的HUVEC增生的抑制率；用流式细胞术检测EPA对VEGF诱导的HUVEC细胞周期的影响；应用免疫组织化学法检测EPA对VEGF受体2(Flk-1)在HUVEC中表达的影响。
结果：培养和传代的HUVEC呈纺锤形及鹅卵石样排列，鉴定Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。6个质量浓度组的EPA对VEGF诱导及非VEGF诱导的HUVEC的增生均有明显的抑制作用，其作用呈质量浓度依赖性(F=23.072，P=0.000)；各质量浓度组的EPA对VEGF诱导的HUVEC的抑制作用强于非VEGF诱导的HUVEC，差异有统计学意义(F=41.417，P=0.000)。各质量浓度组EPA对VEGF诱导的HUVEC作用24、48、72h后，其细胞数逐渐降低(F=87.823，P=0.000)，但作用时间对其抑制作用无明显影响(F=1.495，P=0.236)。EPA使VEGF诱导的HUVEC细胞阻滞在G0/G1期，EPA组G0/G1期细胞数比例为（75.83±1.56）％，对照组为（68.62±1.44）％，差异有统计学意义(t=-5.88，P=0.00)；EPA组与对照组均未发现凋亡细胞。EPA作用后，Flk-1在HUVEC中的阳性染色强度明显弱于对照组，Flk-1阳性细胞数明显减少。
结论：EPA能够通过阻止人血管内皮细胞的DNA合成而明显抑制VEGF诱导的HUVEC的增生，其抑制作用呈剂量依赖性；EPA作用后HUVEC中Flk-1的表达下调，提示EPA可能有抗血管生成的作用。
第二部分二十碳五烯酸对脂多糖处理的人脐静脉内皮细胞核转录因子κB的表达及细胞因子分泌的影响
目的：探讨二十碳五烯酸(EPA)对脂多糖(LPS)处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）核转录因子kB(NF-kB)表达、VEGF、IL-1α和IL-6分泌的影响。
方法：体外生长良好的传代HUVECs分为对照组、LPS组、0.030g/LEPA+LPS处理组、0.050g/LEPA+LPS处理组。LPS组仅加入LPS进行培养，EPA处理组先加入2种浓度的EPA(EPA终浓度分别为0.030g/L和0.050g/L)培养1h，再加入LPS进行培养。LPS刺激6h、12h、24h后，收集各组上清液，ELISA检测上清液中VEGF、IL-1α和IL-6的分泌量；LPS刺激24h后的沉淀细胞，用Western blot法检测HUVECs NF-κ13p65的蛋白表达。
结果：与对照组相比，LPS刺激后，HUVECs NF-κBp65表达和VEGF、IL-1α、IL-6分泌显著升高(P＜0.05)。EPA抑制LPS处理的HUVECs NF-κBp65的蛋白表达、VEGF、IL-1α和IL-6分泌，除LPS刺激后6h， EPA处理组IL-6的分泌量与LPS组比较差异无统计学意义(P＞0.05)外，其余差异均有统计学意义(P＜0.05)。
结论：LPS使HUVECs NF-kB蛋白表达增加，促进其VEGF及细胞因子表达。EPA抑制LPS处理的HUVECs NF-kB的表达、VEGF、细胞因子的分泌，为EPA应用于各种新生血管性疾病和炎症性疾病的防治提供了理论依据。
第三部分二十碳五烯酸对脂多糖诱导人单个核细胞NF-kB的表达及细胞因子分泌的影响
目的：探讨二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的人单个核细胞核转录因子kB(nuclear factorkappa B，NF-kB)的表达、VEGF、IL-1α和IL-6分泌的影响。
方法：将人外周血单个核细胞分为对照组、LPS组、0.030g·L-1EPA处理组、0.050g·L-1EPA处理组。LPS组仅加入LPS进行培养，EPA处理组先加入2种浓度的EPA(使EPA终浓度分别为0.030g·L-1和0.050g·L-1)培养1h，再加入LPS进行培养。LPS刺激6h、12h、24h后，收集各组上清液和LPS刺激24h后的沉淀细胞，Western blot法检测人单个核细胞NF-κBp65的蛋白表达；ELISA检测上清液VEGF、IL-1α和IL-6的分泌量。
结果：LPS刺激6h后，对照组、LPS组、0.030g·L-1EPA处理组、0.050g·L-1EPA处理组VEGF含量(ng·L-1)分别为：22.57±8.86、66.49±4.21、46.18±2.35、45.49±6.61;12h后分别为：18.05±3.18、107.30±5.70、61.29±2.86、54.34±7.41;24h后分别为：20.49±5.92、157.63±5.95、59.54±4.20、53.13±11.42。LPS刺激6h后IL-1α含量(ng·L-1)分别为：15.63±2.98、75.41±4.12、53.60±4.71、31.03±8.49;12h后分别为：40.37±4.51、408.00±47.93、142.80±14.65、99.17±5.86;24h后分别为：63.37±1.99、929.73±27.97、322.03±101.80、161.23±14.59。LPS刺激6h后IL-6含量(ng·L-1)分别为：34.94±2.71、117.60±7.89、82.25±14.56、60.66±2.12;12h后分别为：51.00±6.65、183.60±8.64、127.37±11.48、71.61±8.16；24h后分别为：68.04±21.53、297.50±25.72、132.37±20.87、102.45±21.46。与对照组相比，LPS刺激后，人单个核细胞NF-kBp65的蛋白表达和VEGF、IL-1α、IL-6分泌明显升高。EPA抑制LPS诱导的人单个核细胞NF-κBp65的蛋白表达；下调其VEGF、IL-1α和IL-6分泌，差异有统计学意义(VEGF:F6h=19.147，F12h=77.966，F24h=168.237;1L-1:F6h=39.824,F12h=98.873,F24h=130.118;IL-6:F6h=26.678,F12h=103.401,F24h=63.733.均为P＜0.05）。
结论：LPS使人单个核细胞NF-kB蛋白表达增加，促进其VEGF及细胞因子表达。EPA抑制LPS诱导的人单个核细胞NF-kB蛋白表达，下调其VEGF及细胞因子表达，为EPA应用于各种新生血管性疾病和炎症性疾病的防治提供了理论依据。
第四部分二十碳五烯酸眼表用药对大鼠角膜毒副作用的研究
目的：研究不同剂量二十碳五烯酸大鼠球结膜下注射后的角膜毒副作用。
方法：18只实验大鼠，随机分为3组：0.02EPA处理组、0.03EPA处理组、对照组，每组6只，右眼为实验眼，球结膜下分别注射0.02mg/0.04mlEPA、0.03mg/0.04mlEPA及0.04ml生理盐水。于注药后第1d、第4d、第7d进行裂隙灯显微镜检查，并分别摘取各组2只角膜做光学显微镜和透射电子显微镜检查。
结果：2种浓度EPA处理组各时间段眼部裂隙灯显微镜检查和角膜组织学检查均正常。
结论：EPA眼表局部用药对正常角膜无毒副作用。因此，二十碳五烯酸0.03mg及以下剂量球结膜下注射治疗角膜新生血管是安全可行的。
第五部分二十碳五烯酸对大鼠角膜新生血管血管内皮生长因子及其受体表达的抑制作用
目的：探讨二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)对大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)血管内皮生长因子(VEGF)及其受体Flk-1表达的影响及作用机制。
方法：78只SD大鼠按随机数字表法分为碱烧伤0.02mgEPA治疗组(A组，24只)、碱烧伤0.03mgEPA治疗组(B组，24只)、碱烧伤对照组(C组，24只)、正常组(D组，6只)，除正常组外，均选用右眼制作碱烧伤模型。A、B、C组碱烧伤后立即分别球结膜下注射0.02mg/0.04mlEPA、0.03mg/0.04mlEPA、0.04ml生理盐水。每日裂隙灯显微镜下观察角膜水肿、新生血管情况。碱烧伤后1、4、7、14d，用免疫组织化学方法检测角膜新生血管内皮细胞CD34表达，用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法分别检测角膜VEGF的mRNA表达及Flk-1的蛋白表达。
结果：碱烧伤7d和14d，角膜新生血管相对面积A组：（15.80±6.43）％、(11.06士2.14)％，B组：（16.10±7.41）％、(11.06±2.51)％，均显著少于C组：（84.74士7.77）％、(89.63士7.50)％(P＜0.05)。碱烧伤后7d，C组CD34在CNV内皮细胞强阳性表达，A、B组未见CNV内皮细胞，CD34无表达。C组FLK-1蛋白及VEGF的mRNA表达，碱烧伤后1d最高，持续高表达至4d，随后逐渐下降。碱烧伤4d，A、B组VEGF的mRNA表达及Flk-1的蛋白表达显著低于C组(P＜0.05）。
结论：EPA能通过VEGF途径，抑制VEGF及其受体Flk-1的表达，从而显著抑制角膜新生血管的生长。
第六部分二十碳五烯酸对大鼠角膜新生血管核转录因子κB、细胞因子表达的抑制作用
目的：探讨二十碳五烯酸(EPA)对碱烧伤大鼠角膜新生血管核转录因子κB(NF-κB)、IL-1α、IL-6表达的影响及作用机制。
方法：裂隙灯观察角膜水肿、新生血管。用免疫组织化学方法检测角膜CD34表达，用RT-PCR及蛋白印迹法分别检测角膜IL-1α、IL-6的mRNA表达及NF-κBp65的蛋白表达。
结果：碱烧伤7d和14d，角膜新生血管相对面积A组：（15.80±6.43）％、(11.06±2.14)％，B组：(16.10±7.41)％、(11.06±2.51)％，均显著少于C组：（84.74±7.77）％、(89.63±7.50)％(P＜0.05)。碱烧伤后7d，C组CD34在CNV内皮细胞强阳性表达，A、B组未见CNV内皮细胞，CD34无表达。碱烧伤4d，A、B组IL-1α、IL-6的mRNA表达及NF-κBp65的蛋白表达显著低于C组(P＜0.05)。
结论：EPA能通过NF-κB途径，抑制NF-κB、IL-1α、IL-6的表达，从而显著抑制角膜新生血管的生长。
综合上述研究结果可以得出以下结论：二十碳五烯酸(EPA)能够明显抑制体外培养的VEGF诱导的HUVEC的增生和Flk-1的表达；抑制体外培养的LPS处理的HUVECs和LPS处理的人单个核细胞NF-kB的表达、VEGF、细胞因子IL-1α、IL-6的分泌；SD大鼠眼球结膜下注射EPA对正常角膜无毒副作用，EPA通过VEGF途径，抑制SD大鼠碱烧伤眼VEGF及其受体Flk-1的表达，通过NF-κB途径，抑制SD大鼠碱烧伤眼NF-κB、IL-1α、IL-6的表达，从而显著抑制角膜新生血管的生长。
二十碳五烯酸;角膜新生血管;核转录因子kB;血管内皮生长因子;细胞因子类;角膜移植
河北医科大学
博士
外科学
马景学
2011
中文
R779.65
113
2011-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）